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放射光真空紫外円二色性分光法
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| 概要 円二色性（Circular Dichroism: CD）分光法は，不斉炭素をもつ光学活性物質の立体構造を敏感に反映するため，アミノ酸，糖類，タンパク質，核酸などの生体分子の構造解析法として利用されている。しかし，実験光源を用いた市販のCD装置では，大気の光吸収や光学システムの問題のため，水溶液試料では190 nm程度の波長までしか測定できず，得られる構造情報に限界がある。そこで本研究グループでは，高エネルギー遷移に基づく立体構造解析を可能にするため，広島大学放射光科学研究センター（HiSOR）のビームラインを放射光源とし，高真空下において140 nmまでの真空紫外（VUV）領域でCD測定が可能な真空紫外円二色性（VUVCD）分散計の開発を行いました。通常光源よりも1000倍以上の強力な放射光源を利用し，高速測定制御を備えた新規の光学システムを導入することにより，世界に先駆けてVUVCD装置の実用化に成功している。現在，本装置は全国共同利用共同研究装置に指定され，種々の生体分子の構造解析が可能となっている。 |
| 【真空紫外円二色性分散計の光学システム】 真空紫外円二色性分散計の写真を図1に、その模式図を図2に示す。すべての光学素子は、試料チェンバー（図1の左）と円偏光発生チェンバー（図1の右）内に設置されている。分光器(MON)により単色化された放射光(SR)は，直線偏光子（POL）により直線偏光に偏光された後，光弾性変調子（PEM）により50kHzの左右円偏光に変調される。その後，試料を設置している光学セル(Sample Cell)に照射され，フォトマル（Main-PM）により検知される。本装置には，直線偏光子で発生する異常光を参照光として検出する円偏光制御システム(光サーボリファレンス方式)が導入されている。この参照光により，ロックインアンプ(LIA)の安定性が向上し、またPEMの位相変調が精確に制御される。 |
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図1 図2
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| 試料チェンバー内には、MgF2(あるいはCaF2)窓付き光学セル(光路長：100~1.3 μm) (図3)及びペルチェ素子とエチレングリコールを用いた温度可変機構(温度：70～–20℃) (図4)が設置されている。 | |||
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| 図3 図4 |
| 【真空紫外円二色性分散計を用いた研究内容】 アミノ酸の構造解析 開発したVUVCD分散計を用いて8種類のアミノ酸のVUVCDスペクトルを測定し，190 nm以下のVUV領域に側鎖の種類や長さに依存した特徴的なCDピークが存在することを明らかにした。これら真空紫外領域のCDピークの帰属を行うために、アラニンの構造を基にし，カルボキシル基やアミノ基の回転及びこれら発色団周辺の水分子の数と位置を考慮しながら，密度汎関数法（DFT）法で構造最適化を，時間依存密度汎関数（TDDFT）法でVUVCDスペクトルの計算を行った。その結果，水分子9個の時に260～140 nmの範囲で実測値とよく一致したスペクトルが得られた（図5）。スペクトルの帰属（n-π*，π-π*，n-σ*遷移）をすると共に，水分子ネットワークを含んだ溶液中でのアラニンの立体構造を明らかにした（図6）。 |
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| 図5 図6 （赤；酸素，緑；炭素，青；窒素，白；水素，黄色線；水素結合） |
| 糖類の構造解析 VUVCD装置により，真空紫外領域(高エネルギー領域)のみに吸収帯を持つ糖の構造解析が可能となる。図7に、D-グルコース，D-マンノース，D-ガラクトースのVUVCDスペクトルを示す。市販の装置では観測不可能な180~160nmの波長領域において、C-1のアノマー型(a および β)及びC-5のヒドロキシメチル基のトランス(T) やゴーシュ (G) 型の影響を強く受けたCDが観測できることが分かる。また、単糖類が溶液中で存在する構造(a-GG，a-GT，a-TG，β-GG，β-GT，β-TG )のCDへの寄与を評価するため，D-グルコース，D-マンノース，D-ガラクトースのVUVCDスペクトルを，非線形最小二乗法を利用して6つの独立したガウス成分に分解した(図8にD-グルコースの結果のみを示す)。その結果、D-グルコースとD-マンノースで観測された170 nm付近の正のCDピークにはGG配位が，D-ガラクトースで観測された165 nmと177 nm付近の負のCDピークにはそれぞれGT配位とβ-TG配位が大きく寄与していることが分かり，水溶液中で平衡状態にある糖類の構造に対して新しい情報を得ることを可能にした。 |
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| 図7 図8 | ||
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| 蛋白質の構造解析 典型的なタンパク質のVUVCDスペクトルを図9に示す。4種のタンパク質は，190 nm以下のVUV領域で二次構造の違いを反映した特徴的なCDを示している。VUVCD分光法を用いたタンパク質の二次構造解析では，数十種類の構造既知な参照蛋白質のCDデータベースから，a-helixやβ- strand等の二次構造の成分スペクトルを算出した後、解析プログラムSELCON3等を用いて、未知蛋白質のスペクトル解析により二次構造含量を予測している（図10）。測定波長領域により，予測含量の精度が従来のCD分光と比べ飛躍的に向上し，また3 10 helixやpolyproline II helixの含量及びa-helixとβ-strandの本数も解析可能となっている。さらに，VUVCDからの正確な二次構造情報とNeural Network法によるアミノ酸配列情報の組み合わせから(VUVCD-NN法)，残基レベルでa-helixとβ-strandの位置が精度良く決定できる。また，VUVCDからの二次構造情報は，ホモロジーモデリングから予測される立体構造の検証にも利用されている。特にVUVCDは，変性タンパク質，生体膜に結合したタンパク質，アミロイド線維等，X線結晶学や核磁気共鳴法では比較的困難な非天然状態のタンパク質の精密構造解析に広く用いられている。 |
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| 図9 図10 | ||
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| 【共同利用共同研究】 VUVCD分散計は、共同利用共同研究装置として、国内外のユーザーに利用されています。 問い合わせ先： |
