佐藤明子研究室
- Akiko Satoh's Lab.
- 広島大学 大学院統合生命科学研究科 教授
- 〒739-8521 東広島市 鏡山 1-7-1 広島大学 大学院統合生命科学研究科 C322
- aksatoh(at)hiroshima-u.ac.jp
膜蛋白質やオルガネラ内腔タンパク質、さらに分泌タンパク質 (以降、これらを積荷タンパク質と表現します) は、小胞体膜上で合成された後、シスゴルジ囊に送られ、ゴルジ槽成熟の結果、トランスゴルジ網(TGN)に到達します。TGNは積荷タンパク質の選別の中枢であり、様々な細胞膜ドメインやオルガネラへ輸送されるポストゴルジ小胞が形成され、その内部へとタンパク質が選別されて詰め込まれる、と考えられています。しかし、このTGNにおける積荷タンパク質の選別とその後のポストゴルジ輸送の分子機構については、まだ詳細は不明です。ポストゴルジ輸送はオルガネラの機能維持や細胞膜ドメインの形成・維持に必須な機構であり、生命機能の維持には不可欠な過程です。実際その破綻は、微絨毛封入体病・多発性嚢胞腎・網膜変性症などを含む様々な疾患を引き起こすことが報告されています。つまり、ポストゴルジ輸送の分子機構解明は、細胞生物学の基本的命題であるとともに、その解明により極性輸送欠損が引き起こす様々な疾患についての治療法の開発に直接つながることが期待されます。
佐藤研究室では長年、明瞭な極性をもつショウジョウバエ視細胞をモデルとした極性輸送の研究を行ってきました。この過程で、ゴルジ体のトランス側では3つのRabGEF/Rab が相互にずれ合いながら局在し、特定の膜ドメインへ極性輸送を制御することが明らかにしてきました(図1)。特に、Pcs/Rab11はハエ視細胞ではゴルジ体の最もトランス側と光受容膜基部のポストゴルジ輸送小胞に局在し、Rh1を光受容膜へと届ける役割を持つことを示しましたが、Pcs/Rab11は本来エンドサイトーシス経路で機能する因子であり、リサイクリングエンドソーム(RE)マーカーとして用いられています。そこで、ゴルジ体とREとの関係についての研究を開始しました。
ゴルジ体は生合成されたタンパク質の成熟と選別を行うオルガネラで、シス槽・メディアル槽・トランス槽・TGNが積み重なった層板構造を基本単位としています。一方、REは細胞膜からエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた物質を再び細胞膜へと戻す役割を持っています。両者は独立した異なるオルガネラと考えられています。私達は、ハエの様々な組織、微小管破壊によりゴルジ層板を散在させた哺乳類細胞やウニにおいて、ゴルジ層板とREの関係を検討した結果、REはゴルジ層板付着型(Golgi attached-RE: GA-RE)と遊離型（free-RE）の２つの状態で存在することを見出しました(図2A)。さらに哺乳類やショウジョウバエ培養細胞をライブイメージング観察すると、この2つの状態はREのゴルジ層板に対する付着と遊離の繰り返しによって生じていた（図2A）。植物細胞ではREは定義づけられていないが、ゴルジ体の一部と考えられているトランスゴルジ網(TGN)がゴルジ体のトランス側への接着と解離を繰り返していることが報告されている。研究代表者らの見出した動物細胞におけるREの挙動は、この植物細胞のTGNの挙動と酷似しており、植物TGNと動物REが極めて近い関係にある細胞小器官であることを示している(図ではTGNとREを分離して示した)。次に、HeLa細胞を用いて積荷タンパク質輸送とGA-REの関係を検討した。その結果、積荷タンパク質の種類によってゴルジ層板/TGNからGA-REを経由して細胞膜へと輸送されるものとGA-REを迂回するものとが存在することがわかった (図2B)(Fujii et al., 2020 J Cell Sci. Feb; Fujii et al., 2020 Commun.Integr.Biol.;及び未発表データ）。この結果はゴルジ層板/TGNとREの境界で積荷タンパク質の選別が行われ、一部の積荷タンパク質をREに送り出していることを示している。つまり、ゴルジ層板/TGNとREの境界が、異種の膜系間の境界領域における積荷選別の重要なモデルとなると考えられる。
研究室の研究テーマの枠組の中で、1人1人独立したテーマで研究を行ってもらいます。幾つかのテーマをこちらから提案し、本人の興味に従ってその中から選んでもらいます。私達の研究室では様々な実験手法を用いますが、面白いことに学生さん1人1人によって得意とするところは異なります。ですので、始めたテーマが本人の性質と合わない場合などは本人の意志に基づいて随時変更していきます。また、本人からのテーマの提案もいつでも受け付けます。
(2025年1月現在) (2025年1月現在)
ゴルジ体からの輸送先は、小胞と細胞膜ドメインの融合の特異性によって決まり、この特異性はSNAREタンパク質の組み合わせによって決定されると従来信じられていた。本研究では、ショウジョウバエゲノムに存在するすべてのSNAREタンパク質の機能をRNAiもしくは組織特異的CRISPR/Cas9-KOにより欠損させたショウジョウバエ網膜において、細胞膜ドメイン特異的ポストゴルジ輸送を解析した。その結果、その特異性がSNAREタンパク質のみでは決定できないことを強く示唆した。
(プレスリリース)
本研究では、光により輸送開始をオン/オフできる新しい輸送開始実験法RudLOV法を開発しました。RudLOV法の開発によって、光照射の領域やタイミング、光照射時間を変えることで、輸送開始させる領域・タイミング、積荷タンパク質の輸送量を自由に変えることができるようになりました。本研究では、このRudLOV法の利点を用いることで、積荷タンパク質の種類によって、ゴルジ体内部で異なる場所を経由していることを示すことに成功しました。さらに、dynasorという薬剤が、ゴルジ体への輸送(シス側)及びゴルジ体からの輸送(トランス側)の両方で輸送を阻害するという、これまでに知られていない、新しい作用を発見することに成功しました。
(プレスリリース)
ゴルジ体の基本単位であるゴルジ層板は、哺乳類では核周辺に集合してゴルジリボンを形成するのに対して、植物・線虫・ショウジョウバエなどでは分散していることが知られている。本論文ではホヤやウニにおいてシリア基部の基底小体の周りにリサイクリングエンドソームを中心としてゴルジ体がリング状に集合していることを示した。また、コウイカ・無腸動物においては、ゴルジ層板が集合しているが、ゴルジ層板間の連結はほとんど観察されない。動物界では多くの生物がゴルジ層板を集合化しているが、ゴルジリボン形成には、更なるメカニズムが必要と考えられた。
ゴルジ体の基本単位であるゴルジ層板は、哺乳類では核周辺に集合してゴルジリボンを形成するのに対して、植物・線虫・ショウジョウバエなどでは分散していることが知られている。本研究では、ショウジョウバエにおいてCOPI-SNAREが欠損すると、分散していたゴルジ層板がトランスゴルジ網を中心に集合してミニゴルジリボンを形成することを明らかにした。
(プレスリリース)
neuronal Synaptobrevin (nSyb) は、シナプス小胞の融合に必要であることが確立しているが、私達は、nSybがポストゴルジ小胞の光受容膜への融合にも必要であることを見出した。さらに、nSyb 機能を検討する過程で、光依存的にエンドサイトーシスされたロドプシンが、小胞体で生合成されゴルジ体から輸送されてきたロドプシンとリサイクリングエンドソーム(RE)で混じり合い、nSyb依存的に一緒に光受容膜へと輸送されることを示した。
(プレスリリース)
ショウジョウバエの分散型ゴルジ層板が細胞内を活発に移動し、トランス側で接着と分離を繰り返すことを発見した。さらに、このゴルジ体の分離には、Sec71が必要であり、Sec71の機能を阻害すると。哺乳類細胞のようにゴルジ層板が集合することを見出した。この結果は、動植物種によって異なるゴルジ層板の散在型・集合型という2つの状態が、ゴルジ体の接着と解離の活性のバランスによって決まっていることを示唆している。(プレスリリース)
ハエの様々な組織と微小管を破壊してゴルジ層板を散在された哺乳類細胞において、リサイクリングエンドソーム(RE)がゴルジ層板のトランス側に付着していることを見出していたが(論文4)、本論文ではウニの幼生においても同様にREがゴルジ層板に付着していることを示し、この現象の一般性を報告した。
Rabタンパク質はGEFにより活性化され、エフェクタータンパク質を膜へと集積させることで機能する。私達は以前、光受容膜への輸送には、Pcs(GEF)/Rab11/dRip11とMyoV(エフェクター)が必要であることを示していたが(論文7,16,19)が、光受容膜以外の膜ドメインについてはこれまで知見がなかった。この論文では、Crag(GEF)/Rab10/Ehbp1(エフェクター)の欠損により、Na+K+ATPaseの側底面膜への局在が著しく減弱し、誤ってストーク膜に輸送されること、また、側底面膜の面積が減少し、ストーク膜の面積が増加することを示した。Crag(GEF)/Rab10/Ehbp1が側底面膜方向への輸送を行う因子であると考えられた。
ゴルジ体とリサイクリングエンドソーム(RE)の働きは独立していると考えられていたが、本論文ではREとゴルジ層板の関係を複数のREマーカーを用いてハエの様々な組織と哺乳類細胞において検討し、REにはゴルジ層板付着型（GA-RE）と遊離型（free-RE）の2種類が存在すること、ライブイメージング観察からREがゴルジ層板に対して付着と遊離を繰り返すことでGA-REとfree-REが生じることが分かった。次に、ゴルジ体とREの接着の意義を探るため、生合成された膜タンパク質の輸送をライブイメージングにより観察したところ、積荷タンパク質の種類によってゴルジ層板/TGNからGA-REを経由して細胞膜へと輸送されるものとGA-REを迂回するものとが存在した。この結果は、REがゴルジ体のトランス面に接着することで、膜タンパク質の一部を選別して取り込み、特異的な細胞小器官・細胞膜ドメインへと輸送していることを示している。(プレスリリース)
EMCは一部の複数回膜貫通型タンパク質の合成に必要であること、少なくともロドプシンに関しては、後方の膜貫通ドメインの合成に特異的に必要であることを示した。EMCは比較的親水性の高いヘリックスをSec61受けから取ることで、Sec61が次のヘリックスの膜への挿入に機能できるよう助けることで、複数回膜貫通型タンパク質全体の合成を助けていると考えられた。
ショウジョウバエ視細胞は上皮細胞から分化するが、この発生過程で側底面より軸索が伸長し、また頂端面が微絨毛の束である光受容膜とその周辺のストーク膜とに分化する。本論文では、1)Syndapinとp-Moeによる微絨毛基部のくびれ構造(カタコンベ様構造)の形成と2)接着分子Chpによる微絨毛全体の接着、の2つの機構によって光受容膜が1つにまとめられることを示した。微絨毛膜は50nmの細い筒状構造だが、その根本におけるSyndapin とp-Moeの局在を超解像度顕微鏡2D-STORMを用いて30nm解像度で示すことに成功した。
ショウジョウバエ視細胞は上皮細胞から分化するが、この発生過程で側底面より軸索が伸長し、また頂端面が微絨毛の束である光受容膜とその周辺のストーク膜とに分化する。本論文では、1)Syndapinとp-Moeによる微絨毛基部のくびれ構造(カタコンベ様構造)の形成と2)接着分子Chpによる微絨毛全体の接着、の2つの機構によって光受容膜が1つにまとめられることを示した。微絨毛膜は50nmの細い筒状構造だが、その根本におけるSyndapin とp-Moeの局在を超解像度顕微鏡2D-STORMを用いて30nm解像度で示すことに成功した。
この論文では、Syx5 がショウジョウバエ視細胞において膜タンパク質の小胞体からゴルジ体への輸送に必要であることを示した。 Syx5欠損では、ERからゴルジ体へと輸送されるために小胞にのせられた膜タンパク質は、しばらくゴルジ付近の小胞に蓄積した後、ERに送り直され、はERAD により分解されていることを明らかにした。
この論文では、下のRab6機能解析の論文(2016 PLoS Genet)についての説明に加え、新たにRab6欠損細胞におけるゴルジタンパク質の局在を解析し、シスゴルジタンパク質が正常だが、メディアル以降のゴルジタンパク質がゴルジ体には局在しないこと、これらのタンパク質は細胞質中でゆるい凝集体を形成していることを報告した。この結果から、Rab6はリサイクリングエンドソーム(RE)からトランスゴルジ網(TGN)への逆行性輸送小胞のTGNへの融合に必要だと考え、新たなモデルを提示した。
この論文では、ショウジョウバエ視細胞のストーク膜と光受容膜の両方向への輸送にRab6が必要であることを示した。一方、側底面膜への輸送にはRab6は必要でなかった。Rab6がトランスゴルジ網(TGN)からリサイクリングエンドソーム(RE)にかけて局在し、TGNでは側底面膜輸送に関わるクラスリンと、REでは光受容膜輸送に関わるRab11と共局在した。これらの結果から、まず側底面への選別がTGNで行われ、頂端面へ輸送される膜タンパク質は共にRab6によってREに輸送された後、光受容膜の膜タンパク質はRab11依存的に、ストーク膜の膜タンパク質は未同定の因子により各ドメインへ特異的に輸送されるという段階的選別モデルを提案した。
この論文では,小胞体膜タンパク質複合体（EMC）が複数回膜貫通型タンパク質の生合成と安定的な発現に関与する重要な因子であることを発見し、さらに、EMCの欠損が網膜変性症の発症に関与する可能性を示唆した。EMCは複数回膜貫通型タンパク質に特異的に作用し、膜貫通部位のポリペプチド鎖の膜への挿入、もしくは複数膜貫通ドメインのフォールディング（立体構造に折りたたまれる現象）に関与すると考えられた。
ショウジョウバエ視細胞は4つの異なる細胞膜区画を持つが、この内の1区画である光受容膜へのロドプシンの輸送に、GPI生合成に関与する遺伝子PIGが必要であることを見出した。PIG 変異体では、ロドプシンはゴルジ体へと正常に輸送された後、ポストゴルジ小胞に詰め込まれずに分解された。また、別の細胞膜区画に輸送されるNa+K+ATPase・Crb が、光受容膜にも誤って輸送された。この結果は、GPI 生合成がトランスゴルジ網での膜タンパク質の選別に必要であることを示している。
光情報変換カスケードの活性化によるカルシウム上昇が、ミオシンIIIからのアレスチンの遊離を引き起こすことで、アレスチンの細胞質から光受容膜への移行がおこり、メタロドプシンが不活性化されることを示した。本研究の間接蛍光抗体法によるアレスチンとミオシンIIIの局在解析を担当した。
アレスチンは活性型ロドプシンに結合し、そのシグナルを止める蛋白質である。光照射により細胞質から光受容膜に移動することが知られているが、その移動機構に関しては論争があり、解明されていなかった。本論文は、アレスチンがロドプシンの異性化量に対し化学量論的に移動すること、また、この移動が光情報伝達シグナルによる細胞内カルシュウム濃度の増加により加速されることを示した。本研究の間接蛍光抗体法による解析の殆どを担当した。
本論文では、メタロドプシンによる光情報変換カスケードの活性化によるカルシウム上昇が、カルモジュリンとミオシンIII依存的にアレスチンのメタロドプシンへの結合を促進することで、メタロドプシンを不活性化することを明らかにした。本研究の間接蛍光抗体法によるアレスチンとカルモジュリンの局在解析を担当した。
ショウジョウバエ視細胞内の色素顆粒は明暗で位置が異なり、光順応に貢献している 。明所では光受容膜の直下にあり、光受容膜内に入った光を吸収し、視細胞の光感度を低下させる。暗所では光受容膜から離れ、細胞質中に拡散していると考えられていた。本論文では、完全暗所固定した組織を観察し、色素顆粒が光受容膜から一定の距離を保ち、光受容膜基部のアクチン繊維(RTW) の外側に並んでいる事を見いだした。さらに、 光による色素顆粒の光受容膜直下への移動に、ミオシンVとカルモジュリンが必要だと分かった。また、Rab 蛋白質の１つ、Lightoid がミオシンVを色素顆粒に繋ぐ役割を持つ事も示した。
Delelopment,2005の論文では、光受容膜へのロドプシンの輸送に、Rab11が必要であることを示していたが、本論文では、さらに、Rab11 結合タンパク質であるdRip11/MyoVがRab11と複合体を形成しており、共に、光受容膜へのロドプシンの輸送に必要な事を生化学的・組織学的に示した。光受容膜直下には、RTW(retinal terminal web) とよばれるアクチン繊維の束が形成されているが、Rab11/dRip11/MyoVが複合体は、このアクチンの束の内部にポストゴルジ小胞を輸送し光受容膜基部へと係留させる役割を持つことがわかった。
本論文では、ショウジョウバエ視細胞におけるロドプシンが光依存的にエンドサイトーシスされることを発見した。また、視細胞にはアレスチン1とアレスチン2が発現するが、このうちのアレスチン1がロドプシンの光依存的エンドサイトーシスに必要であることを示した。また、アレスチン1の欠損視細胞は縮退を示すが、この過程は光により促進された。さらに、アレスチン1の欠損視細胞の暗所における縮退は、アレスチン2の欠損により完全にレスキューされた。この結果は、アレスチン1依存的光活性化エンドサイトーシスによるシグナルが、アレスチン2による細胞傷害性のシグナルを押さえる役割を持つことを示していると考えられる。
ロドプシンは蛋白質部分を形成するオプシンと発色団レチナールからなるが、小胞体上で翻訳されたオプシンは、発色団11シスレチナールが結合して初めて小胞体から輸送される。本論文では、青色光によるレチナールの異性化を用いた、ロドプシンの輸送開始実験系(BLICS)を用いて、ロドプシンの輸送経路を形態学的に同定した。また、Rab11がゴルジ体のトランス面とRh1をのせたポストゴルジ小胞に局在しており、ゴルジ後の輸送に必要な事を示した。
本論文では、RabRP1 のクローニングと機能解析を行った。RabRP1は、眼と精巣に特異的に発現するタンパク質であり、C末端の1/3がRabタンパク質と高い相同性を示す。このC末端の1/3のRabドメインは、機能の知られていないRab29, 32, 38 と高い相同性を示した。抗体を作成して局在を解析したところ、RabRP1 が色素顆粒に局在することがわかった。RabRP1ドミナントネガティブタンパク質の発現によりオートファジー小胞が多数観察された。この結果から、RabRP1 は色素顆粒の合成やタンパク質分解などに関与するリソソーム経路に必要であると考えられた。本研究において、RabRP1のクローニング・抗体作成・ドミナントネガティブ変異体の作成を担当した。
本論文では、カロチノイド欠乏培地で飼育したショウジョウバエ視細胞の形態学的解析を行った。カロチノイド欠乏視細胞では、ゴルジ体の形態と数は通常の培地で飼育したハエの視細胞と違いはミられなかったが、小胞体が3倍に増幅しており、光受容膜の面積が約半分程度に減少することを示した。しかしながら輸送に関わるRabタンパク質の発現には違いが見られなかった。従って、カロチノイド欠乏によって小胞輸送のシステムには変化がないが、ロドプシン合成が欠損するために、小胞体と光受容膜に形態的な変化が引き起こされることがわかった。
ロドプシンは蛋白質部分を形成するオプシンと発色団レチナールからなるが、小胞体上で翻訳されたオプシンは、発色団11シスレチナールが結合して初めて小胞体から輸送される。本論文では、青色光によるレチナールの異性化を用いた、ロドプシンの輸送開始実験系を開発し、Rab1が小胞体からゴルジ体への輸送必要な事を生化学的に示した。また、Rab1の欠損によって、小胞体が増幅し、ゴルジ体が小胞化すること、視細胞の縮退が引き起こされることを発見した。従って、Rab1は小胞体からゴルジ体へのロドプシンの輸送に必要なだけでなく、その欠損が網膜変性症を引き起こす可能性を示唆した。
本論文では、ショウジョウバエ視細胞で発現する14のRabタンパク質cDNAの一部、さらにこのうちの9つのRabタンパク質については全長cDNAを初めてクローニングし同定した。10種類のRabタンパク質はRab1,2,3,4,6,7,8,10,11,14と高い相同性を示し、そのオーソログと考えられた。4つについては、高い相同性をしめすRabは存在しなかったが、Rabに共通するコンセンサス配列を持っているため、新規Rab タンパク質と考えられたので、RabRP1,2,3,4と命名した。さらに、RabRP3,4についてはGTP結合能を持つことを確認した。
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特別研究（卒業論文）・大学院での研究について
担当授業科目
研究室メンバー
OBメンバーと研究テーマ
ショウジョウバエ視細胞においてnSyb/Sybは頂端面へのポストゴルジ輸送とリサイクリング輸送を制御する
電子顕微鏡を用いたSNARE欠損表現型の解析
ショウジョウバエ視細胞におけるParcasの機能解析
膜タンパク質生合成における小胞体膜タンパク質複合体(EMC)の機能解析
ゴルジ体とリサイクリングエンドソームの動態制御機構の解明
ショウジョウバエ視細胞を用いた極性輸送に関与する因子のRNAi法による探索
APEX2を用いた電子顕微鏡レベルでのタンパク質局在解析法のショウジョウバエ視細胞研究への導入
ショウジョウバエ視細胞における積荷タンパク質の同調的輸送開始法の開発
頂端面内部ドメイン形成におけるsyndapin遺伝子の機能解析
ショウジョウバエ視細胞での極性輸送機構の解明
ゴルジ体の集合と離散のメカニズムに関係する因子の解明
融合型光受容膜を示す11のspam 様変異体の解析
ロドプシン輸送の欠損変異体のスクリーニングと電子顕微鏡観察
ショウジョウバエ視細胞における色素顆粒輸送に関わる因子の変異体探索
ショウジョウバエ Pob遺伝子の機能解析
ショウジョウバエ視細胞におけるロドプシン輸送の欠損変異体の単離
ロドプシン輸送の欠損変異体のスクリーニングと機能解析研究業績
原著論文
総説・寄稿等