佐藤明子研究室
- Akiko Satoh's Lab.
- 広島大学・大学院総合科学研究科 教授
- 〒739-8521 東広島市 鏡山 1-7-1 広島大学 総合科学研究科 B411
- aksatoh(at)hiroshima-u.ac.jp
ほとんどすべての膜タンパク質は、小胞体膜上で合成され、その後、細胞内小胞輸送によって特異的な細胞内小器官や細胞膜に輸送されます。細胞内小胞輸送の分子機構解明が生物学において重要課題であることは平成25年度のノーベル医学生理学賞が小胞輸送の分子機構の解明に関わる3人の研究者、Randy Schekman（ランディ・シェクマン）博士、James Rothman（ジェームズ・ロスマン）博士、Thomas Südhof（トーマス・ズートホフ）博士に送られたことでも明らかですね
この20-30年間、細胞内小胞輸送の分子機構は培養細胞や酵母を用いて活発に研究され、多くの知見が得られてきたました。しかし多細胞生物の体を構成する細胞の多くは多方向性で調節性の小胞輸送機構を持っており、それにより複雑で多様な細胞形態を形成することで高次な機能を実現していますが、このような膜タンパク質の選別輸送(極性輸送)の分子機構はまだよく分かっていません。このような極性輸送の研究は、高等動物や植物中にin situ に存在する細胞を用いる必要があります。近年、これらの過程の欠損が様々な疾患をもたらすことが理解されるようになり、高等動物・植物を用いた膜輸送システムの研究が世界的に盛んになってきました。
私達の研究グループでは、ショウジョウバエ網膜を用いて膜タンパク質の選別輸送機能の研究に取り組んでいます。ショウジョウバエ視細胞は、頂端面の一部が増幅した光受容膜・その周辺のストーク膜・側底面膜・軸索とシナプスという少なくとも4つの明瞭に分極化した細胞膜区画を持ちます(図1)。私達は、視細胞のこの4つの膜区画を形作る選別輸送システムの全容を明らかにし、さらに視細胞以外の細胞における役割も検討していきたいと考えています。このために私達は独自に開発したロドプシン輸送開始実験法(図2)や簡便なロドプシンの細胞内局在観察法(図3)とショウジョウバエ遺伝学を組合せ、精巧な実験系を作り上げてきました。
細胞膜が光受容膜・ストーク膜・細胞体膜・軸索の4つの異なる膜ドメインに分かれており、各々異なる膜タンパク質が局在しています。
水浸法(*注1)という方法を用いると生きたハエの視細胞で発現する蛍光タンパク質の局在を直接観察できます。これまで作成されたロドプシンGFP融合蛋白質は、小胞体からの輸送に問題があり、野生型のロドプシンのように後期蛹で光受容膜に蓄積しませんでしたが、佐藤の作成した Arrestin2::GFPは、GFPの励起に必要な 488nmの光照射により同時に形成されるメタロドプシンに結合するアレスチンの活性のため、極めて正確に内在性のロドプシンの局在を示します。(Pichaud and Desplan の方法を一部改変)。
*注1:水浸法:生きたハエをアガロース包埋することにより角膜による屈折を打ち消すことができます。水浸レンズを装備した共焦点レーザー顕微鏡で観察することにより、個眼内部の蛍光タンパク質の分布を観察できます。
(A)青色光により11-cis retinal を生成することでロドプシン輸送を開始できる
(B)輸送開始前後のロドプシン(Rh1)の局在．ゴルジ体, ポストゴルジ小胞, 光受容膜への移動が観察可能
また、ヒトとハエの目の構造は一見全く異なっていますが、網膜発生および視細胞機能の多くに共通性がみられ、特にロドプシン輸送の欠損はハエとヒトの両方で網膜色素変性症の原因となることが分かっているので、ロドプシン輸送の分子機構を明らかにすることで網膜変性症の発症機構の解明と治療法の開発にも貢献していきたいと考えています。
研究室の研究テーマの枠組の中で、1人1人独立したテーマで研究を行ってもらいます。幾つかのテーマをこちらから提案し、本人の興味に従ってその中から選んでもらいます。私達の研究室では様々な実験手法を用いますが、面白いことに学生さん1人1人によって得意とするところは異なります。ですので、始めたテーマが本人の性質と合わない場合などは本人の意志に基づいて随時変更していきます。また、本人からのテーマの提案もいつでも受け付けます。
(2021年4月現在)
(2021年4月現在)
ショウジョウバエの分散型ゴルジ層板が細胞内を活発に移動し、トランス側で接着と分離を繰り返すことを発見した。さらに、このゴルジ体の分離には、Sec71が必要であり、Sec71の機能を阻害すると。哺乳類細胞のようにゴルジ層板が集合することを見出した。この結果は、動植物種によって異なるゴルジ層板の散在型・集合型という2つの状態が、ゴルジ体の接着と解離の活性のバランスによって決まっていることを示唆している。(プレスリリース)
ハエの様々な組織と微小管を破壊してゴルジ層板を散在された哺乳類細胞において、リサイクリングエンドソーム(RE)がゴルジ層板のトランス側に付着していることを見出していたが(論文4)、本論文ではウニの幼生においても同様にREがゴルジ層板に付着していることを示し、この現象の一般性を報告した。
Rabタンパク質はGEFにより活性化され、エフェクタータンパク質を膜へと集積させることで機能する。私達は以前、光受容膜への輸送には、Pcs(GEF)/Rab11/dRip11とMyoV(エフェクター)が必要であることを示していたが(論文7,16,19)が、光受容膜以外の膜ドメインについてはこれまで知見がなかった。この論文では、Crag(GEF)/Rab10/Ehbp1(エフェクター)の欠損により、Na+K+ATPaseの側底面膜への局在が著しく減弱し、誤ってストーク膜に輸送されること、また、側底面膜の面積が減少し、ストーク膜の面積が増加することを示した。Crag(GEF)/Rab10/Ehbp1が側底面膜方向への輸送を行う因子であると考えられた。
ゴルジ体とリサイクリングエンドソーム(RE)の働きは独立していると考えられていたが、本論文ではREとゴルジ層板の関係を複数のREマーカーを用いてハエの様々な組織と哺乳類細胞において検討し、REにはゴルジ層板付着型（GA-RE）と遊離型（free-RE）の２種類が存在すること、ライブイメージング観察からREがゴルジ層板に対して付着と遊離を繰り返すことでGA-REとfree-REが生じることが分かった。次に、ゴルジ体とREの接着の意義を探るため、生合成された膜タンパク質の輸送をライブイメージングにより観察したところ、積荷タンパク質の種類によってゴルジ層板/TGNからGA-REを経由して細胞膜へと輸送されるものとGA-REを迂回するものとが存在した。この結果は、REがゴルジ体のトランス面に接着することで、膜タンパク質の一部を選別して取り込み、特異的な細胞小器官・細胞膜ドメインへと輸送していることを示している。(プレスリリース)
EMCは一部の複数回膜貫通型タンパク質の合成に必要であること、少なくともロドプシンに関しては、後方の膜貫通ドメインの合成に特異的に必要であることを示した。EMCは比較的親水性の高いヘリックスをSec61受けから取ることで、Sec61が次のヘリックスの膜への挿入に機能できるよう助けることで、複数回膜貫通型タンパク質全体の合成を助けていると考えられた。
ショウジョウバエ視細胞は上皮細胞から分化するが、この発生過程で側底面より軸索が伸長し、また頂端面が微絨毛の束である光受容膜とその周辺のストーク膜とに分化する。本論文では、1)Syndapinとp-Moeによる微絨毛基部のくびれ構造(カタコンベ様構造)の形成と2)接着分子Chpによる微絨毛全体の接着、の2つの機構によって光受容膜が1つにまとめられることを示した。微絨毛膜は50nmの細い筒状構造だが、その根本におけるSyndapin とp-Moeの局在を超解像度顕微鏡2D-STORMを用いて30nm解像度で示すことに成功した。
ショウジョウバエ視細胞は上皮細胞から分化するが、この発生過程で側底面より軸索が伸長し、また頂端面が微絨毛の束である光受容膜とその周辺のストーク膜とに分化する。本論文では、1)Syndapinとp-Moeによる微絨毛基部のくびれ構造(カタコンベ様構造)の形成と2)接着分子Chpによる微絨毛全体の接着、の2つの機構によって光受容膜が1つにまとめられることを示した。微絨毛膜は50nmの細い筒状構造だが、その根本におけるSyndapin とp-Moeの局在を超解像度顕微鏡2D-STORMを用いて30nm解像度で示すことに成功した。
この論文では、Syx5 がショウジョウバエ視細胞において膜タンパク質の小胞体からゴルジ体への輸送に必要であることを示した。 Syx5欠損では、ERからゴルジ体へと輸送されるために小胞にのせられた膜タンパク質は、しばらくゴルジ付近の小胞に蓄積した後、ERに送り直され、はERAD により分解されていることを明らかにした。
この論文では、下のRab6機能解析の論文(2016 PLoS Genet)についての説明に加え、新たにRab6欠損細胞におけるゴルジタンパク質の局在を解析し、シスゴルジタンパク質が正常だが、メディアル以降のゴルジタンパク質がゴルジ体には局在しないこと、これらのタンパク質は細胞質中でゆるい凝集体を形成していることを報告した。この結果から、Rab6はリサイクリングエンドソーム(RE)からトランスゴルジ網(TGN)への逆行性輸送小胞のTGNへの融合に必要だと考え、新たなモデルを提示した。
この論文では、ショウジョウバエ視細胞のストーク膜と光受容膜の両方向への輸送にRab6が必要であることを示した。一方、側底面膜への輸送にはRab6は必要でなかった。Rab6がトランスゴルジ網(TGN)からリサイクリングエンドソーム(RE)にかけて局在し、TGNでは側底面膜輸送に関わるクラスリンと、REでは光受容膜輸送に関わるRab11と共局在した。これらの結果から、まず側底面への選別がTGNで行われ、頂端面へ輸送される膜タンパク質は共にRab6によってREに輸送された後、光受容膜の膜タンパク質はRab11依存的に、ストーク膜の膜タンパク質は未同定の因子により各ドメインへ特異的に輸送されるという段階的選別モデルを提案した。
この論文では,小胞体膜タンパク質複合体（EMC）が複数回膜貫通型タンパク質の生合成と安定的な発現に関与する重要な因子であることを発見し、さらに、EMCの欠損が網膜変性症の発症に関与する可能性を示唆した。EMCは複数回膜貫通型タンパク質に特異的に作用し、膜貫通部位のポリペプチド鎖の膜への挿入、もしくは複数膜貫通ドメインのフォールディング（立体構造に折りたたまれる現象）に関与すると考えられた。
ショウジョウバエ視細胞は4つの異なる細胞膜区画を持つが、この内の1区画である光受容膜へのロドプシンの輸送に、GPI生合成に関与する遺伝子PIGが必要であることを見出した。PIG 変異体では、ロドプシンはゴルジ体へと正常に輸送された後、ポストゴルジ小胞に詰め込まれずに分解された。また、別の細胞膜区画に輸送されるNa+K+ATPase・Crb が、光受容膜にも誤って輸送された。この結果は、GPI 生合成がトランスゴルジ網での膜タンパク質の選別に必要であることを示している。
光情報変換カスケードの活性化によるカルシウム上昇が、ミオシンIIIからのアレスチンの遊離を引き起こすことで、アレスチンの細胞質から光受容膜への移行がおこり、メタロドプシンが不活性化されることを示した。本研究の間接蛍光抗体法によるアレスチンとミオシンIIIの局在解析を担当した。
アレスチンは活性型ロドプシンに結合し、そのシグナルを止める蛋白質である。光照射により細胞質から光受容膜に移動することが知られているが、その移動機構に関しては論争があり、解明されていなかった。本論文は、アレスチンがロドプシンの異性化量に対し化学量論的に移動すること、また、この移動が光情報伝達シグナルによる細胞内カルシュウム濃度の増加により加速されることを示した。本研究の間接蛍光抗体法による解析の殆どを担当した。
本論文では、メタロドプシンによる光情報変換カスケードの活性化によるカルシウム上昇が、カルモジュリンとミオシンIII依存的にアレスチンのメタロドプシンへの結合を促進することで、メタロドプシンを不活性化することを明らかにした。本研究の間接蛍光抗体法によるアレスチンとカルモジュリンの局在解析を担当した。
ショウジョウバエ視細胞内の色素顆粒は明暗で位置が異なり、光順応に貢献している 。明所では光受容膜の直下にあり、光受容膜内に入った光を吸収し、視細胞の光感度を低下させる。暗所では光受容膜から離れ、細胞質中に拡散していると考えられていた。本論文では、完全暗所固定した組織を観察し、色素顆粒が光受容膜から一定の距離を保ち、光受容膜基部のアクチン繊維(RTW) の外側に並んでいる事を見いだした。さらに、 光による色素顆粒の光受容膜直下への移動に、ミオシンVとカルモジュリンが必要だと分かった。また、Rab 蛋白質の１つ、Lightoid がミオシンVを色素顆粒に繋ぐ役割を持つ事も示した。
Delelopment,2005の論文では、光受容膜へのロドプシンの輸送に、Rab11が必要であることを示していたが、本論文では、さらに、Rab11 結合タンパク質であるdRip11/MyoVがRab11と複合体を形成しており、共に、光受容膜へのロドプシンの輸送に必要な事を生化学的・組織学的に示した。光受容膜直下には、RTW(retinal terminal web) とよばれるアクチン繊維の束が形成されているが、Rab11/dRip11/MyoVが複合体は、このアクチンの束の内部にポストゴルジ小胞を輸送し光受容膜基部へと係留させる役割を持つことがわかった。
本論文では、ショウジョウバエ視細胞におけるロドプシンが光依存的にエンドサイトーシスされることを発見した。また、視細胞にはアレスチン1とアレスチン2が発現するが、このうちのアレスチン1がロドプシンの光依存的エンドサイトーシスに必要であることを示した。また、アレスチン1の欠損視細胞は縮退を示すが、この過程は光により促進された。さらに、アレスチン1の欠損視細胞の暗所における縮退は、アレスチン2の欠損により完全にレスキューされた。この結果は、アレスチン1依存的光活性化エンドサイトーシスによるシグナルが、アレスチン2による細胞傷害性のシグナルを押さえる役割を持つことを示していると考えられる。
ロドプシンは蛋白質部分を形成するオプシンと発色団レチナールからなるが、小胞体上で翻訳されたオプシンは、発色団11シスレチナールが結合して初めて小胞体から輸送される。本論文では、青色光によるレチナールの異性化を用いた、ロドプシンの輸送開始実験系(BLICS)を用いて、ロドプシンの輸送経路を形態学的に同定した。また、Rab11がゴルジ体のトランス面とRh1をのせたポストゴルジ小胞に局在しており、ゴルジ後の輸送に必要な事を示した。
本論文では、RabRP1 のクローニングと機能解析を行った。RabRP1は、眼と精巣に特異的に発現するタンパク質であり、C末端の1/3がRabタンパク質と高い相同性を示す。このC末端の1/3のRabドメインは、機能の知られていないRab29, 32, 38 と高い相同性を示した。抗体を作成して局在を解析したところ、RabRP1 が色素顆粒に局在することがわかった。RabRP1ドミナントネガティブタンパク質の発現によりオートファジー小胞が多数観察された。この結果から、RabRP1 は色素顆粒の合成やタンパク質分解などに関与するリソソーム経路に必要であると考えられた。本研究において、RabRP1のクローニング・抗体作成・ドミナントネガティブ変異体の作成を担当した。
本論文では、カロチノイド欠乏培地で飼育したショウジョウバエ視細胞の形態学的解析を行った。カロチノイド欠乏視細胞では、ゴルジ体の形態と数は通常の培地で飼育したハエの視細胞と違いはミられなかったが、小胞体が3倍に増幅しており、光受容膜の面積が約半分程度に減少することを示した。しかしながら輸送に関わるRabタンパク質の発現には違いが見られなかった。従って、カロチノイド欠乏によって小胞輸送のシステムには変化がないが、ロドプシン合成が欠損するために、小胞体と光受容膜に形態的な変化が引き起こされることがわかった。
ロドプシンは蛋白質部分を形成するオプシンと発色団レチナールからなるが、小胞体上で翻訳されたオプシンは、発色団11シスレチナールが結合して初めて小胞体から輸送される。本論文では、青色光によるレチナールの異性化を用いた、ロドプシンの輸送開始実験系を開発し、Rab1が小胞体からゴルジ体への輸送必要な事を生化学的に示した。また、Rab1の欠損によって、小胞体が増幅し、ゴルジ体が小胞化すること、視細胞の縮退が引き起こされることを発見した。従って、Rab1は小胞体からゴルジ体へのロドプシンの輸送に必要なだけでなく、その欠損が網膜変性症を引き起こす可能性を示唆した。
本論文では、ショウジョウバエ視細胞で発現する14のRabタンパク質cDNAの一部、さらにこのうちの9つのRabタンパク質については全長cDNAを初めてクローニングし同定した。10種類のRabタンパク質はRab1,2,3,4,6,7,8,10,11,14と高い相同性を示し、そのオーソログと考えられた。4つについては、高い相同性をしめすRabは存在しなかったが、Rabに共通するコンセンサス配列を持っているため、新規Rab タンパク質と考えられたので、RabRP1,2,3,4と命名した。さらに、RabRP3,4についてはGTP結合能を持つことを確認した。