サリチル酸は植物が作る低分子の二次代謝産物で植物ホルモン作用を示す。Klessig らのグループは多種類のサリチル酸結合タンパク質を発見し、サリチル酸は他のホルモンとは異なり多種多様な target 標的分子を持つと提唱している。それだけでなく、化学的にも興味深い機能性を持つことでよく研究に使われている。 薬としてもサリチル酸をアセチル化したアスピリンがとても有用に長年使われている。 サリチル酸について調べたことをここに書いておく。
サリチル酸のような低分子と標的タンパク質の相互作用を計算によって評価できるようになった。多くの論文で「Molecular Docking」の計算がされている。それについても調べてみる。Molecular_dockingについて 私は計算化学、計算生物学には詳しくないので確かなことは言えないが、サリチル酸のような小さい分子ではどんなタンパク質に対してでも同じようなドッキングの結果になってしまうような気がする。2021年に AlphaFold によってタンパク質の立体構造が高精度に計算推定され UniProt などのデータベースにも入力された。それらのすばらしい成果、リソースをどのように自分の研究に生かすかを考えないといけない。神戸大学計算科学教育研究センターから、「計算生命科学の基礎」遠隔インタラクティブ講義が開催、公開されている。 http://www.eccse.kobe-u.ac.jp/distance_learning/life_science9/ 計算生命科学の基礎9、第三回では森脇先生による講義「タンパク質の立体構造予測−AlphaFold以前と以後−」が行われている。
2024 年に Salicylic Acid in Plant Immunity and Beyond. Spoel SH, Dong X. Plant Cell. 2024 Jan 2:koad329. doi: 10.1093/plcell/koad329. PMID: 38163634 というすばらしい総説が発表された。
例えば「salicylic iron (copper) coordinate」で検索するとたくさん出てくる。 水酸基、カルボキシ基の部分で金属イオンに配位できる。
サリチル酸に対する最も重要な受容体である NPR1 タンパク質とサリチル酸の結合には銅イオンが必要であると言うことが示されていた。
The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Wu Y, Zhang D, Chu JY, Boyle P, Wang Y, Brindle ID, De Luca V, Després C. Cell Rep. 2012 Jun 28;1(6):639-47. doi: 10.1016/j.celrep.2012.05.008. Epub 2012 Jun 15. PMID: 22813739
しかし NPR1 の構造生物学研究の成果 Structural basis of NPR1 in activating plant immunity Nature. 2022 May 11. doi: 10.1038/s41586-022-04699-w. Online ahead of print. Shivesh Kumarなど PMID: 35545668 には、銅イオンは出てこなかった。システインとヒスチジンに配位した亜鉛イオンが含まれていた。
鉄イオンとサリチル酸の強い関係は、生物学的にも示されている。
Involvement of endogenous salicylic acid in iron-deficiency responses in Arabidopsis. Shen C, Yang Y, Liu K, Zhang L, Guo H, Sun T, Wang H. J Exp Bot. 2016 Jul;67(14):4179-93. doi: 10.1093/jxb/erw196. Epub 2016 May 21. PMID: 27208542
ホウ素は植物の必須元素である。ホウ酸とサリチル酸が配位するらしい。
Synthesis, structure characterization, photoluminescence properties and TD-DFT calculations for two new borates. Hadjadj N, Dems MA, Merazig H, Bendjeddou L. Acta Crystallogr C Struct Chem. 2018 Apr 1;74(Pt 4):411-417. doi: 10.1107/S2053229618002681. Epub 2018 Mar 7. PMID: 29620023
Berthelot reaction はアンモニアの定量に使われる。アンモニウムイオンが、次亜塩素酸、ニトロプルシドの共存下でサリチル酸などのフェノール性化合物と反応して青く発色する。
Characterization of hydroxyl free radical mediated damage to plasmid pBR322 DNA. Schneider JE, Browning MM, Zhu X, Eneff KL, Floyd RA. Mutat Res. 1989 Sep;214(1):23-31. PMID: 2549408 という論文のアブストラクトで、「OH trapping agents, salicylate and deoxyguanosine,」と書かれている。ヒドロキシルラジカルと反応して消去する作用をもつ化合物として使われている。
Determination of hydroxyl radicals using salicylate as a trapping agent by gas chromatography-mass spectrometry. Luo X, Lehotay DC. Clin Biochem. 1997 Feb;30(1):41-6. PMID: 9056108 サリチル酸がヒドロキシルラジカルと反応すると、ベンゼン環にもう一つ水酸基が付いた化合物が生成する。血清中に含まれるそれらの化合物を酸性条件下で酢酸エチル抽出し、トリメチルシリル化して GC-MS で分析している。動物細胞を酸化ストレスにさらすとサリチル酸から catechol, 2,3-DHBA, and 2,5-DHBA が生じたと書かれている。
Galactinol and raffinose constitute a novel function to protect plants from oxidative damage Plant Physiol. 2008 Jul;147(3):1251-63. Ayako Nishizawa 1 , Yukinori Yabuta, Shigeru Shigeoka PMID: 18502973 PMCID: PMC2442551 DOI: 10.1104/pp.108.122465
植物に乾燥耐性を与えるガラクチノールとラフィノースには、試験管内での、ヒドロキシルラジカルによるサリチル酸の水酸化を抑える作用があることを実験によって示している。
Reactions of hydroxyl radicals with benzoic acid and benzoate pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2017/ra/c7ra05488b
安息香酸もヒドロキシルラジカルと反応する。反応生成物は複数生じうる。量子化学計算によって反応定数などを計算できている。
Identification of products from oxidation of uric acid induced by hydroxyl radicals. Hicks M, Wong LS, Day RO. Free Radic Res Commun. 1993;18(6):337-51. doi: 10.3109/10715769309147501. PMID: 8397146
プリン塩基分解系の中間体である尿酸もヒドロキシルラジカルと反応する。尿酸は高い活性酸素 ROS 消去活性を持つことがよく知られている。しかし植物では尿酸が蓄積すると有害な作用があり、その濃度はとても低いことが多い。例外としては、種子に尿酸を蓄積している植物種も知られている。乾燥耐性に役立っているのだろう。
Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance Plant Cell. 2014 Jul;26(7):3090-100. doi: 10.1105/tpc.114.124008. Epub 2014 Jul 22. Oliver K Hauck など PMID: 25052714 PMCID: PMC4145134
ヒドロキシルラジカルとよく反応する分子は、脂質や DNA などとヒドロキシルラジカルが反応しにくくなることによりストレス耐性を高める可能性がある。
Adenine oxidation by pyrite-generated hydroxyl radicals. Cohn CA, Fisher SC, Brownawell BJ, Schoonen MA. Geochem Trans. 2010 Apr 26;11(1):2. doi: 10.1186/1467-4866-11-2. PMID: 20420694
光化学系がストレスを受けると一重項酸素というタイプの活性酸素が生じる。一重項酸素がサリチル酸と反応して 2, 5-ジヒドロ安息香酸が生じる。
Formation of 2,5-dihydroxybenzoic acid during the reaction between singlet oxygen (1O2) and salicylic acid: analysis by ESR oximetry and HPLC with electrochemical detection B. Kalyanaraman, Sujatha Ramanujam, Ravinder J. Singh, Joy Joseph, and Jimmy B. Feix Cite this: J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10, 4007–4012 Publication Date:May 1, 1993 https://doi.org/10.1021/ja00063a021
スーパーオキサイドと一酸化窒素が反応すると ONOO- という活性窒素化合物が生じる。ONOO- も、サリチル酸と反応して 2, 3-DHBA が生じる。このことを用いてヒドロキシルラジカル and/or ONOO- の検出に使われている。
The effect of inhaled nitric oxide and oxygen on the hydroxylation of salicylate in rat lungs Pediatr Res. 2003 Sep;54(3):337-43. doi: 10.1203/01.PDR.0000079183.85517.CE. Epub 2003 Jun 4. Leif D Nelin など PMID: 12788987
ONOO- の場合、サリチル酸がニトロ化される反応も起きる。このことでヒドロキシルラジカルと ONOO- の区別が可能になる。
Hydroxylation of salicylate and phenylalanine as assays for hydroxyl radicals: a cautionary note visited for the third time Free Radic Res. 1997 Sep;27(3):239-44. doi: 10.3109/10715769709065762. B Halliwell など PMID: 9350428
ヒドロキシルラジカルは細胞に対して毒として働くだけかと思っていたが、そうでもないらしい。
In vivo cell wall loosening by hydroxyl radicals during cress seed germination and elongation growth. Müller K, Linkies A, Vreeburg RA, Fry SC, Krieger-Liszkay A, Leubner-Metzger G. Plant Physiol. 2009 Aug;150(4):1855-65. doi: 10.1104/pp.109.139204. Epub 2009 Jun 3. PMID: 19493972
細胞壁は生長や発芽に同期して必要な時期に必要な場所が緩む必要がある。ふつうグルカナーゼやエクスパンシン、XTH, ペクチナーゼなどが働いていると考えられているが、ヒドロキシルラジカルによって糖鎖が分解される場合もあることが示されている。ストレス状態、貯蔵栄養が不足した状態で発芽しようとする場合、酵素を十分な量だけ合成して分泌することは難しくなる。そういう場合にヒドロキシルラジカルが役立つのかもしれない。
The hydroxyl radical in plants: from seed to seed J Exp Bot. 2015 Jan;66(1):37-46. doi: 10.1093/jxb/eru398. Epub 2014 Oct 7. Siân L Richards など PMID: 25294918
Action of phenolic derivatives (acetaminophen, salicylate, and 5-aminosalicylate) as inhibitors of membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical scavengers. Dinis TC, Maderia VM, Almeida LM. Arch Biochem Biophys. 1994 Nov 15;315(1):161-9. PMID: 7979394
Protoporphyrin IX: the Good, the Bad, and the Ugly. Sachar M, Anderson KE, Ma X. J Pharmacol Exp Ther. 2016 Feb;356(2):267-75. doi: 10.1124/jpet.115.228130. Epub 2015 Nov 20. Review. PMID: 26588930
サリチル酸が ferrochelatase を阻害すると Protoporphyrin IX が増加する。
他の種類の lipoxygenase inhibitor とサリチル酸を同時に与えると、その阻害剤の阻害作用を打ち消すというデータが出されている。
Interactions of inhibitors of the lipoxygenase and cyclooxygenase pathways with a supplementary binding site on soybean lipoxygenase Br. J. Pharmac. (1984), 83, 959-964 I. Baumann, J. Baumann, & G. Wurm
Cyclooxygenase, Lipoxygenase は活性中心に鉄原子がある。そこにサリチル酸が配位して活性に影響を与える。
Evidence against specific binding of salicylic acid to plant catalase. Rüffer M, Steipe B, Zenk MH. FEBS Lett. 1995 Dec 18;377(2):175-80. PMID: 8543045
カタラーゼは過酸化水素を消去する活性を持つ、ヘムを含むタンパク質である。この酵素にサリチル酸が結合することが示されている。 アコニターゼは FeS クラスターを含むタンパク質で細胞質、ミトコンドリアでクエン酸の代謝を行う酵素である。この酵素にもサリチル酸が結合して阻害する。 FeS クラスターを含む酵素、タンパク質は細胞内に多数存在する。ミトコンドリアの SDH コハク酸デヒドロゲナーゼはその一つである。SDH とサリチル酸に関係があることが報告されている。
Salicylic Acid-Dependent Plant Stress Signaling via Mitochondrial Succinate Dehydrogenase. Belt K, Huang S, Thatcher LF, Casarotto H, Singh KB, Van Aken O, Millar AH. Plant Physiol. 2017 Apr;173(4):2029-2040. doi: 10.1104/pp.16.00060. PMID: 28209841
サリチル酸は SDHとユビキノンの結合部位またはその近傍に作用して、ミトコンドリアからの活性酸素 H2O2 の生成を促進することで、その作用の一部を npr1 と関係なくもたらす。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/pdb/1FIQ 動物の Xanthine oxidase の立体構造が報告されている。 1FIQ が accession number である。高次構造を決めるために結晶化をするが、その際にサリチル酸を加えている。
論文： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC27090/ Crystal structures of bovine milk xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase: Structure-based mechanism of conversion Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26; 97(20): 10723–10728. doi: 10.1073/pnas.97.20.10723 PMCID: PMC27090 PMID: 11005854 Cristofer Enrothら サリチル酸は基質と拮抗的に動物の XO の活性部位に結合して阻害剤として働き、補酵素として酵素に結合しているモリブデンコファクターを安定化すると書かれている。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4334109/ という論文にもサリチル酸が出てくる。
というタイトルの論文が大津先生らのグループによって発表されている。 https://jsn.or.jp/journal/document/52_4/499-504.pdf
Oxidation of salicylates by stimulated granulocytes: evidence that these drugs act as free radical scavengers in biological systems. Sagone AL Jr, Husney RM. J Immunol. 1987 Apr 1;138(7):2177-83. PMID: 3031158
Salicylic acid: old and new implications for the treatment of type 2 diabetes? Rena G, Sakamoto K. Diabetol Int. 2014;5(4):212-218. Epub 2014 Jun 12. PMID: 27656338
The ancient drug salicylate directly activates AMP-activated protein kinase. Hawley SA, Fullerton MD, Ross FA, Schertzer JD, Chevtzoff C, Walker KJ, Peggie MW, Zibrova D, Green KA, Mustard KJ, Kemp BE, Sakamoto K, Steinberg GR, Hardie DG. Science. 2012 May 18;336(6083):918-22. doi: 10.1126/science.1215327. Epub 2012 Apr 19. PMID: 22517326
AMPK: mediating the metabolic effects of salicylate-based drugs? Steinberg GR, Dandapani M, Hardie DG. Trends Endocrinol Metab. 2013 Oct;24(10):481-7. doi: 10.1016/j.tem.2013.06.002. Epub 2013 Jul 19. PMID: 23871515
植物でも、ATP 欠乏に対応する独自の仕組みが植物細胞に存在することを明らかにした、 すばらしい研究成果が 2019 年に報告されている。 SnRK1 Kinase and the NAC Transcription Factor SOG1 Are Components of a Novel Signaling Pathway Mediating the Low Energy Response Triggered by ATP Depletion. Hamasaki H, Kurihara Y, Kuromori T, Kusano H, Nagata N, Yamamoto YY, Shimada H, Matsui M. Front Plant Sci. 2019 May 10;10:503. doi: 10.3389/fpls.2019.00503. eCollection 2019. PMID: 31134102
SnRK1 は動物の AMPK に相当する働きをする。 Mechanisms of regulation of SNF1/AMPK/SnRK1 protein kinases. Crozet P, Margalha L, Confraria A, Rodrigues A, Martinho C, Adamo M, Elias CA, Baena-González E. Front Plant Sci. 2014 May 20;5:190. doi: 10.3389/fpls.2014.00190. eCollection 2014. Review. PMID: 24904600
植物：植物のストレスシグナル伝達とエネルギーシグナル伝達で働く、中心的な転写ネットワーク統合因子 2007年8月23日 Nature 448, 7156 doi: 10.1038/nature06069 SnRK1 の一種 KIN10とKIN11（別名はそれぞれ、AKIN10/AT3g01090、AKIN11/AT3g29160）の重要な役割が示されている。これらはエネルギー源である糖により不活性化される。
KIN10 をプロトプラストで強制発現させて6時間後の mRNA の蓄積量を測定したマイクロアレイデータが GSE8257 で公開されている。植物を暗黒処理した際に誘導される DIN (Dark-induced) 遺伝子が共通して発現が高くなっている。リボソーマルタンパク質の発現は対照的に共通して低下している。
よい総説 THE AMP-ACTIVATED/SNF1 PROTEIN KINASE SUBFAMILY: Metabolic Sensors of the Eukaryotic Cell? Annual Review of Biochemistry Volume 67, 1998 Hardie, pp 821-855 https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.biochem.67.1.821 植物の SNF1-Related Protein Kinases の標的として HMG-COA REDUCTASE イソプレノイド生合成経路、sucrose phosphate synthase (SPS) ショ糖合成、 and nitrate reductase (NR) 硝酸還元、 sucrose synthase ショ糖分解系 トレハロース生合成などが挙げられている。
The SnRK1 Kinase as Central Mediator of Energy Signaling between Different Organelles. Wurzinger B, Nukarinen E, Nägele T, Weckwerth W, Teige M. Plant Physiol. 2018 Feb;176(2):1085-1094. doi: 10.1104/pp.17.01404. Epub 2018 Jan 8. Review. No abstract available. PMID: 29311271 アブシジン酸の作用が SnRK1 を活性化するという図面がある。ストレス状態での余計な ATP 消費を抑えるのだろう。活性酸素 ROS は対照的に SnRK1 を不活性化すると書かれている。
AMPK の阻害剤が植物 (tim50 変異体) に対して効果を示すことが報告されている。 Arabidopsis mitochondrial protein TIM50 affects hypocotyl cell elongation through intracellular ATP level. Kumar S, Yoshizumi T, Hongo H, Yoneda A, Hara H, Hamasaki H, Takahashi N, Nagata N, Shimada H, Matsui M. Plant Sci. 2012 Feb;183:212-7. Epub 2011 Sep 6. PMID: 22195596
SnRK1 がサリチル酸で活性化されるという報告はない。 AMPK を活性化する分子は AMP, サリチル酸以外にもいくつか発見されているらしい。それらは植物に効くだろうか。 SnRK1 を活性化する・阻害する分子を見つけることは社会的意義が大きい課題だろう。
SnRK1 はトレハロース-6-リン酸 Tre6P で強く阻害され、細胞内でも活性調節を受けることが発見されている。糖がシグナルとして働く経路の一つになっている。ストレス耐性を向上させることにつながり重要な研究テーマになっている。Tre6P の合成、分解（トレハロース合成）に関わる酵素、それらをコードする遺伝子の活性を制御することでストレス耐性が向上するという論文がいくつもある。
Inhibition of SNF1-related protein kinase1 activity and regulation of metabolic pathways by trehalose-6-phosphate. Zhang Y, Primavesi LF, Jhurreea D, Andralojc PJ, Mitchell RA, Powers SJ, Schluepmann H, Delatte T, Wingler A, Paul MJ. Plant Physiol. 2009 Apr;149(4):1860-71. doi: 10.1104/pp.108.133934. Epub 2009 Feb 4. PMID: 19193861
Arabidopsis thaliana trehalose-6-phosphate phosphatase gene TPPI enhances drought tolerance by regulating stomatal apertures. Lin Q, Wang S, Dao Y, Wang J, Wang K. J Exp Bot. 2020 Jul 6;71(14):4285-4297. doi: 10.1093/jxb/eraa173. PMID: 32242234
動物で AMPK を活性化する方法が研究されている。
AMPK: A Target for Drugs and Natural Products With Effects on Both Diabetes and Cancer D. Grahame Hardie Diabetes 2013 Jul; 62(7): 2164-2172. https://doi.org/10.2337/db13-0368
AMP-activated protein kinase activation and NADPH oxidase inhibition by inorganic nitrate and nitrite prevent liver steatosis. Cordero-Herrera I, Kozyra M, Zhuge Z, McCann Haworth S, Moretti C, Peleli M, Caldeira-Dias M, Jahandideh A, Huirong H, Cruz JC, Kleschyov AL, Montenegro MF, Ingelman-Sundberg M, Weitzberg E, Lundberg JO, Carlstrom M. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Jan 2;116(1):217-226. doi: 10.1073/pnas.1809406115. Epub 2018 Dec 17. PMID: 30559212
硝酸イオンは植物では発芽を促進することがよく知られている。硝酸イオンはアンモニウムイオンによる生育阻害を打ち消すこともよく知られている。動物でも硝酸イオンがミトコンドリアの機能を高めるという論文がある。 Can Dietary Nitrates Enhance the Efficiency of Mitochondria? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3049330/ それにも AMPK が関係するのだろうか。
種子の成熟時のように通常の ATP 合成が進行しにくい際には、アデニレートキナーゼ による ATP 合成 2ADP → ATP + AMP が進行する。 Water content, adenylate kinase, and mitochondria drive adenylate balance in dehydrating and imbibing seeds J Exp Bot. 2017 Jun 15; 68(13): 3501–3512. Published online 2017 Jul 20. doi: 10.1093/jxb/erx182 PMCID: PMC5853452 PMID: 28859379 Marie-Paule Raveneau, Abdelilah Benamar, and David Macherel その際には AMP が大きく増加する。種子が吸水して発芽する際には急速に ATP が増加して AMP は減少する。
メトホルミンという薬は AMPK を活性化する。 細胞生物学：低用量メトホルミンはPEN2を介してリソソームのAMPK経路を標的にする 2022年3月3日 Nature 603, 7899 doi: 10.1038/s41586-022-04431-8
ケルセチンは植物が作る二次代謝産物で健康によいことが知られている。こういう論文もあった。 Quercetin-Induced AMP-Activated Protein Kinase Activation Attenuates Vasoconstriction Through LKB1-AMPK Signaling Pathway. Kim SG, Kim JR, Choi HC. J Med Food. 2018 Feb;21(2):146-153. doi: 10.1089/jmf.2017.4052. Epub 2017 Oct 16. PMID: 29035613 「ケルセチンは AMP を増加させる」と書いてある解説もあった。 https://syodokukai.exblog.jp/d2012-05-22/
Mechanical properties and antibacterial activities of novel starch-based composite films incorporated with salicylic acid. Fang Y, Fu J, Tao C, Liu P, Cui B. Int J Biol Macromol. 2020 Jul 15;155:1350-1358. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.11.110. PMID: 31743704
The origin and evolution of salicylic acid signaling and biosynthesis in plants Mol Plant. 2023 Jan 2;16(1):245-259. doi: 10.1016/j.molp.2022.12.002. Epub 2022 Dec 6. Xianqing Jia など PMID: 36476805
植物が地上で生育するように進化した際に、サリチル酸は光ストレスから細胞を保護する作用を果たしていたと考えられる。
Salicylic Acid Protects Photosystem II by Alleviating Photoinhibition in Arabidopsis thaliana under High Light Int J Mol Sci. 2020 Feb 12;21(4):1229. doi: 10.3390/ijms21041229. Yang-Er Chen など PMID: 32059402 PMCID: PMC7072977
SA サリチル酸のシグナル伝達には NPR1 という重要な因子が働いている。「サリチル酸誘導性遺伝子」としてよく研究されている主要遺伝子はほとんどすべて NPR1 に依存していることが遺伝子発現データで示されている。 しかし、植物には NPR1 と関係なくサリチル酸が働く仕組みもある。それにはミトコンドリアが関与していることが示されている。
Salicylic Acid-Dependent Plant Stress Signaling via Mitochondrial Succinate Dehydrogenase. Belt K, Huang S, Thatcher LF, Casarotto H, Singh KB, Van Aken O, Millar AH. Plant Physiol. 2017 Apr;173(4):2029-2040. doi: 10.1104/pp.16.00060. PMID: 28209841
サリチル酸は SDHとユビキノンの結合部位またはその近傍に作用して、ミトコンドリアからの活性酸素 H2O2 の生成を促進することで、その作用の一部を NPR1 と関係なくもたらす。
ずっと以前からサリチル酸は電子伝達系を阻害するというデータが出されていた。それはかなり高い濃度（100 μM以上）で作用が出るものだった。Belt らの論文では、「SA は complex II の機能に 10 μM で影響を与える (Fig. 5B)」と書かれている。単離したミトコンドリアに SA を加えて、SQR activity (Succinate : quinone reductase) という活性を測定している。また単離したミトコンドリアからの活性酸素生成を低濃度の SA が促進することを示している (Fig. 6)。 しかし、生きた植物体に SA を与える実験では、7 mM という高濃度の SA を短時間 (40 分）与え、 その後 20 時間レポーターの発光を観測するという方法をとっている。こちらも低濃度で効くなら完璧なのだろうが、そうは書いてない。これは 1 mM の書き間違いかもしれない。Gleason et al. 10.1073/pnas.1016060108 の Supporting information では 1 mM になっている。
Gleason et al. 10.1073/pnas.1016060108 を見ると benzoic acid でも強いプロモーター活性化効果がある。
Knockout analysis of Arabidopsis transcription factors TGA2, TGA5, and TGA6 reveals their redundant and essential roles in systemic acquired resistance. Zhang Y, Tessaro MJ, Lassner M, Li X. Plant Cell. 2003 Nov;15(11):2647-53. doi: 10.1105/tpc.014894. Epub 2003 Oct 23. PMID: 14576289
この論文の Fig. 2 で、200μM のサリチル酸を含む培地で野生型は普通に生育できるが、npr1-1 変異体、また NPR1 と連携して働く TGA2,5,6 転写因子が全部欠失した変異体では芽生えが白くなってしまうことを示した写真が掲載されている。培地は「MS medium」とだけ書いてある。こういう場合、糖を加えると生育阻害から回復することが多い。たぶん糖を加えていないのではないか。栄養塩を加えているのに糖がないと発芽が悪くなりやすく、少しの刺激ですぐに生育が抑制されやすい。
このことはサリチル酸には潜在的に生育抑制作用（例えば呼吸の阻害）があり、NPR1 を介したサリチル酸のホルモン作用がそれを解毒・不活性化（SA の水酸化など）していることを示している。しかし npr1 変異体は普通に育成すると野生型と同じようによく生育する。生育に適した培地、芽生えからもっと生長した状態では、生育抑制作用は光合成による糖の増加などによって打ち消されてサリチル酸が抑制する度合いは小さくなるのだろう。
Trade-off between synthesis of salicylates and growth of micropropagated Salix pentandra. Ruuhola T, Julkunen-Titto R. J Chem Ecol. 2003 Jul;29(7):1565-88. PMID: 12921436 サリチル酸の生合成を押さえることで生育がよくなる場合がある。
Plant J. 2010 Nov;64(3):511-23. doi: 10.1111/j.1365-313X.2010.04345.x. Epub 2010 Sep 28. Elongator subunit 2 is an accelerator of immune responses in Arabidopsis thaliana Christopher T DeFraia ら PMID: 20807211 では、1/2 MS 培地に 0.26 mM SA を加えた培地を使っている。野生型は正常に芽生えが生育するが、npr1 は生育が悪い。gns1 という変異と二重変異になると回復する。菌が感染すると npr1 は高濃度の SA を蓄積する（遊離型 SA：野生型は 1 µg / g FW npr1 は 6 µg / g FW） gns1npr1 変異体では野生型レベルに戻る。 GNS1 遺伝子は At1g49540 encodes AtELP2, the second subunit of the Elongator complex だった。Fig.8 を見ると npr1 は PR-1 と WRKY18 遺伝子の SA 誘導性がとても低くなるが、ICS1 （At1g74710）や At4g39670, At4g27280 の誘導はほとんど変わらない。 しかし他の NPR1 に関する RNAseq, マイクロアレイのデータを見るとそんな違いはないのでこれはあまり当てにならない。複数の遺伝子発現データを見ていると、ICS1 はサリチル酸で発現量があまり変化しないことのほうが多い。
「Recent reports indicated that plant Elongator mutants, including Atelp1, Atelp2, Atelp4, and Atelp6, are resistant to oxidative stress produced by methyl viologen」と書かれている。ELP がない方が酸化ストレスに強くなる。NPR1 は逆に強く発現させると酸化ストレスに強くなる。
HDA19 is required for the repression of salicylic acid biosynthesis and salicylic acid-mediated defense responses in Arabidopsis Plant J. 2012 Jul;71(1):135-46. doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.04977.x. Epub 2012 Apr 13. Sun-Mee Choi など PMID: 22381007 には、
「It is known that TGA2 and TGA5 act as transcriptional repressors of PR1 under uninfected conditions but turn into transcriptional activators upon pathogen infection (Zhang et al., 2003; Rochon et al., 2006; Kesarwani et al., 2007; Boyle et al., 2009). 」 と書かれている。PR1 は発現していないときと発現しているときの差が大きい傾向がある。そのことと一致している。
The TGA Transcription Factors from Clade II Negatively Regulate the Salicylic Acid Accumulation in Arabidopsis Int J Mol Sci. 2022 Oct 1;23(19):11631. doi: 10.3390/ijms231911631. Alejandro Fonseca など PMID: 36232932
という論文があった。
Belt らの論文に、「SA は複合体 III と結合する」という論文が引用されている。
Mitochondrial-derived reactive oxygen species play a vital role in the salicylic acid signaling pathway in Arabidopsis thaliana. Nie S, Yue H, Zhou J, Xing D. PLoS One. 2015 Mar 26;10(3):e0119853. doi: 10.1371/journal.pone.0119853. eCollection 2015. PMID: 25811367
同じ著者でこういう論文もあるが、Retract されている。
A Potential Role for Mitochondrial Produced Reactive Oxygen Species in Salicylic Acid-Mediated Plant Acquired Thermotolerance. Nie S, Yue H, Xing D. Plant Physiol. 2015 Oct 15. pii: pp.00719.2015. doi: 10.1104/pp.15.00719. Epub 2015 Oct 15. Retraction in: Plant Physiol. 2016 Mar;170(3):1895. PMID: 26099269
サリチル酸が複合体III を阻害するという論文は、いくつかの生物種で存在する。しかし活性酸素に与える影響については主張が分かれている。あまり安易に「これは活性酸素が増えたせいだ」と決めつけるのはよくないかもしれない。
SA inhibits complex III activity to generate reactive oxygen species and thereby induces GA overproduction in Ganoderma lucidum. Liu R, Cao P, Ren A, Wang S, Yang T, Zhu T, Shi L, Zhu J, Jiang AL, Zhao MW. Redox Biol. 2018 Jun;16:388-400. doi: 10.1016/j.redox.2018.03.018. Epub 2018 Mar 31. PMID: 29631100 この論文ではサリチル酸が活性酸素生成を促進することになっている。
J Bioenerg Biomembr. 2011 Jun;43(3):237-46. doi: 10.1007/s10863-011-9357-4. Epub 2011 May 25. Characterization of Rubus Fruticosus Mitochondria and Salicylic Acid Inhibition of Reactive Oxygen Species Generation at Complex III/Q Cycle: Potential Implications for Hypersensitive Response in Plants Wagner Rodrigo de Souza 1 , Ricardo Vessecchi, Daniel Junqueira Dorta, Sérgio Akira Uyemura, Carlos Curti, Carem Gledes Vargas-Rechia PMID: 21611778 Rubus Fruticosus はブラックベリー
この論文には、「SA inhibits the electron transport chain by inactivating the semiquinone radical during the Q cycle」と書かれている。 複合体 III において、ユビキノンは電子の受容・放出を繰り返し酸化型と還元型を取る。酸化型と還元型の間に、ユビセミキノンラジカルが生じる。さらにユビキノンの酸化還元とプロトンの輸送が共役して効率よく起きる仕組みがある。これを Q cycle という。 ユビセミキノンラジカルは本来電子をシトクロム b に渡してユビキノールに変化する。しかしそれがうまくいかないと電子を酸素に渡すことでユビキノールに変化する。 酸素はそれによって活性酸素の一種である不対電子をもつスーパーオキサイドに変化する。 複合体 III の阻害剤であるアンチマイシンはシトクロム b の働きを阻害するのでスーパーオキサイドの生成を強く促進する。
この論文を見ると、サリチル酸はスーパーオキサイドの生成を促進していない。アンチマイシンと同時に与えると、アンチマイシンによるスーパーオキサイドの生成を阻害する。 Fig. 6 には、サリチル酸はユビキノンと同様に電子を受け取ってラジカルになることができると書いてある。 またサリチル酸はユビセミキノンラジカルと反応して、活性酸素を生成しにくいユビキノール型への変化を促進すると書かれている。これらの効果によってサリチル酸は複合体 III からのスーパーオキサイドの生成を抑制する。
この理屈が正しければ、サリチル酸は複合体III の機能を阻害する変異や阻害剤による活性酸素の生成を抑えて生育をよくする作用を果たす可能性がある。
From sunscreens to medicines: Can a dissipation hypothesis explain the beneficial aspects of many plant compounds? Phytother Res. 2020 Aug;34(8):1868-1888. doi: 10.1002/ptr.6654. Epub 2020 Mar 12. Alistair V W Nunn ら PMID: 32166791 PMCID: PMC7496984 という論文では、サリチル酸などの植物由来の化合物がミトコンドリアでの活性酸素生成などに与える、有用な効果について論じられている。
Inhibition of mitochondrial complex I by various non-steroidal anti-inflammatory drugs and its protection by quercetin via a coenzyme Q-like action Chem Biol Interact. 2012 Jul 30;199(1):18-28. doi: 10.1016/j.cbi.2012.05.006. Epub 2012 May 28. Cristian Sandoval-Acuña など PMID: 22652335 という論文では、ケルセチンが Coenzyme Q の代用としてミトコンドリア電子伝達系の電子の流れを回復させるというようなことが示されている。ケルセチンはストレス耐性を高めるという論文はいくつもある。サリチル酸に同じような作用があるかどうかは書かれていない。
サリチル酸は電子伝達を阻害する。アンカプラー活性もある。
Salicylic acid is an uncoupler and inhibitor of mitochondrial electron transport. Norman C, Howell KA, Millar AH, Whelan JM, Day DA. Plant Physiol. 2004 Jan;134(1):492-501. Epub 2003 Dec 18. PMID: 14684840
植物で発熱するものがある。その現象に、サリチル酸とミトコンドリアが関与していることがある。Uncoupling protein (UCP) が関与している。Alternative oxidase (AOX) も関与しており、発熱時に活性が高くなる。
Salicylic Acid: a natural inducer of heat production in arum lilies. Raskin I, Ehmann A, Melander WR, Meeuse BJ. Science. 1987 Sep 25;237(4822):1601-2. PMID: 17834449
Regulation of heat production in the inflorescences of an Arum lily by endogenous salicylic acid. Raskin I, Turner IM, Melander WR. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Apr;86(7):2214-8. PMID: 16594020
Molecular identity of uncoupling proteins in thermogenic skunk cabbage. Ito-Inaba Y, Hida Y, Mori H, Inaba T. Plant Cell Physiol. 2008 Dec;49(12):1911-6. doi: 10.1093/pcp/pcn161. Epub 2008 Oct 30. PMID: 18974196
Thioredoxin o-mediated reduction of mitochondrial alternative oxidase in the thermogenic skunk cabbage Symplocarpus renifolius. Umekawa Y, Ito K. J Biochem. 2019 Jan 1;165(1):57-65. doi: 10.1093/jb/mvy082. PMID: 30289493 AOX はチオレドキシンによって還元されると活性が高くなる。この植物の場合はサリチル酸と関係なく、AOX 活性が高い。
発熱を赤外線カメラで観測することができる。
Heat Production in the Voodoo Lily (Sauromatum guttatum) as Monitored by Infrared Thermography. Skubatz H, Nelson TA, Meeuse BJ, Bendich AJ. Plant Physiol. 1991 Apr;95(4):1084-8. PMID: 16668094
Infrared thermography of Arum lily inflorescences. Skubatz H, Nelson TA, Dong AM, Meeuse BJ, Bendich AJ. Planta. 1990 Oct;182(3):432-6. doi: 10.1007/BF02411396. PMID: 24197195
発熱植物ではサリチル酸がミトコンドリアに働いて発熱を引き起こす。ミトコンドリアもサリチル酸も、発熱植物ではない普通の植物にも存在して重要な働きをしている。 普通の植物でも、外部から観測できるほどではないがサリチル酸の量が増加した状態では細胞内にミトコンドリアから熱が放出されることもあるかもしれない。
熱がサリチル酸の作用を抑えるという論文が 2022 年に発表された。もし、サリチル酸によって細胞内にミトコンドリアから熱が多量に放出されるならば、それによってサリチル酸の作用が抑えられるという負のフィードバック機構になり、サリチル酸の過剰な蓄積を抑えるのに役立つかもしれない。
Increasing the resilience of plant immunity to a warming climate Nature. 2022 Jun 29. doi: 10.1038/s41586-022-04902-y. Online ahead of print. Jong Hum Kim など PMID: 35768511
Evaluation of thermoregulation of different pine organs in early spring and estimation of heat reward for the western conifer seed bug (Leptoglossus occidentalis) on male cones PLoS One. 2022 Aug 4;17(8):e0272565. doi: 10.1371/journal.pone.0272565. eCollection 2022. Ryotaro Kitajima 1, Osamu Matsuda 2, Koji Mastunaga 3, Ryotaro Hara 1, Atsushi Watanabe 1, Atsushi Kume PMID: 35925894 PMCID: PMC9352051
この場合は器官が太陽光を受けることで温度が上昇する。雄花の松かさ male cone は太陽光を受けて温度が上昇しやすい。Western conifer seed bug (Leptoglossus occidentalis) マツヘリカメムシ（略してWCSB）は温度が高いこと（など・他にも揮発性分子なども働いている）を目印として雄花の松かさを見つける。male cone にはたくさんの花序 inflorescence がついているので熱が放散しにくい。
Arabidopsis cell suspension culture and RNA sequencing reveal regulatory networks underlying plant-programmed cell death. Burke R, McCabe A, Sonawane NR, Rathod MH, Whelan CV, McCabe PF, Kacprzyk J.Plant J. 2023 Aug 2. doi: 10.1111/tpj.16407. Online ahead of print. PMID: 37531399
ANAC017, ANAC013 が出てくる。サリチル酸も出てくる。
植物では NPR1 タンパク質がサリチル酸による転写制御に主要な役割を果たしている。
NPR1-independent な転写制御の仕組みもあるという論文もある。しかしそれは主要な作用ではない。 Oxicam-type non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit NPR1-mediated salicylic acid pathway. Ishihama N, Choi SW, Noutoshi Y, Saska I, Asai S, Takizawa K, He SY, Osada H, Shirasu K. Nat Commun. 2021 Dec 15;12(1):7303. doi: 10.1038/s41467-021-27489-w. PMID: 34911942 で公開されている遺伝子発現データには、npr1 変異体でサリチル酸の効果が半分以下になった遺伝子、そうでない遺伝子のリストがある。よく研究されているサリチル酸誘導性遺伝子は、全部 NPR1 に依存して制御されていることがわかる。
動物に NF(kappa)B という有名で重要な転写因子がある。その働きを抑える I(kappa)B という因子をリン酸化する酵素の働きを、サリチル酸が抑える。
The anti-inflammatory agents aspirin and salicylate inhibit the activity of I(kappa)B kinase-beta. Yin MJ, Yamamoto Y, Gaynor RB. Nature. 1998 Nov 5;396(6706):77-80. PMID: 9817203
Structural basis of NPR1 in activating plant immunity Nature. 2022 May 11. doi: 10.1038/s41586-022-04699-w. Online ahead of print. Shivesh Kumarなど PMID: 35545668
NPR1 は過酸化水素で処理されると多量体を形成する (Fig. 2f)。以前 NPR1 と銅イオンの関係が示されていたが、この論文に銅イオンは出てこなかった。システインとヒスチジンに配位した亜鉛イオンが含まれていた。 Cys150, Cys155, His157, Cys160 が亜鉛との結合に関わっていることがわかった。
Cys156 はタンパク質の表面に突き出していて溶媒と接触し、 redox sensor として働いていることがわかった。 このシステインが Ala に変化するとオリゴマーを形成しなくなるので活性型のモノマーになりやすい。また Cys82 もオリゴマー形成を促進する。
C 末端の方に SA Binding Domain (SBD) が存在する。
Key residues for maintaining architecture, assembly of plant hormone SA receptor NPR1 Biochem Biophys Res Commun. 2022 Jul 12;613:94-99. doi: 10.1016/j.bbrc.2022.04.119. Epub 2022 Apr 29. Chaoguang Ji など PMID: 35550200 という論文では、
「 The conserved residue His80 is the key residue that maintains the oligomerization of NPR1」と書かれている。
His80 は BTB ドメインに存在する。以前の論文では Cys82 が S-S 結合を形成していると主張されていた。しかし Ji らの分析では Cys82 は NPR1 タンパク質の多量体化に影響はなかった。Ji らの分析でも NPR1 タンパク質には亜鉛が含まれていることが示された。Cys150, Cys155, His157, Cys160 が亜鉛との結合に関わっているらしいことがわかった。これは構造生物学研究の結果と一致している。
金属イオンを含む重要なタンパク質の高次構造がいくつも報告されている。 Structures of Arabidopsis thaliana oxygen-sensing plant cysteine oxidases 4 and 5 enable targeted manipulation of their activity Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Sep 15;117(37):23140-23147. doi: 10.1073/pnas.2000206117. Epub 2020 Aug 31. Mark D White など PMID: 32868422 PMCID: PMC7502726 PCO タンパク質は酸素に依存して基質となる転写因子のシステイン残基を酸化する。鉄が含まれていて、ヒスチジンに配位している。
システイン残基は様々なタンパク質において様々な翻訳後修飾を受ける。 An atlas of Arabidopsis protein S-acylation reveals its widespread role in plant cell organization and function Nat Plants. 2022 Jun 9. doi: 10.1038/s41477-022-01164-4. Manoj Kumar ら PMID: 35681017 ではシステイン残基がアシル化 脂肪酸で修飾されたタンパク質の分析を行っている。
The emerging role of biomolecular condensates in plant immunity Plant Cell. 2022 Apr 26;34(5):1568-1572. doi: 10.1093/plcell/koab240. Wei Wang, Yangnan Gu PMID: 34599333 PMCID: PMC9048959
PMID: 32888491 、PMID: 35792034 PMID: 33913240 PMID: 34434210 にも解説文がある。
Formation of NPR1 Condensates Promotes Cell Survival during the Plant Immune Response. Zavaliev R, Mohan R, Chen T, Dong X. Cell. 2020 Sep 3;182(5):1093-1108.e18. doi: 10.1016/j.cell.2020.07.016. Epub 2020 Aug 17. PMID: 32810437
NPR1 タンパク質と GFP タンパク質の融合タンパク質は、高濃度のサリチル酸によって細胞質で相分離（liquid-liquid phase separation, LLPS）による分子凝集体を形成することが示された。
NPR1 タンパク質には intrinsically disordered regions (IDRs) と呼ばれる領域がある。IDRs はタンパク質間相互作用に働く。
NPR1 はサリチル酸と結合して核へ移行して転写を活性化する。それだけでなく、高濃度のサリチル酸は細胞質において SINCs (SA-induced NPR1 condensates) という名称がついた分子凝集体を形成する。SINCs には CUL3 という E3 ligase、またサリチル酸で活性化される細胞死促進分子 NLR receptors, EDS1, WRKY54/70 が含まれている。CUL3 の働きによって細胞死を促進する分子は分解されるので、細胞死が起きにくくなる。
核に移行してしまった NPR1 は SINCs を形成できない。菌が感染した部位では NPR1 は分解されてしまうので SINCs は形成されない。そのため細胞死が起きて菌が拡がりにくくなる。感染部位から離れた部分では、SA による SINCs の形成によって細胞死が防がれる。
しかし、 Oxicam-type non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit NPR1-mediated salicylic acid pathway. Ishihama N, Choi SW, Noutoshi Y, Saska I, Asai S, Takizawa K, He SY, Osada H, Shirasu K. Nat Commun. 2021 Dec 15;12(1):7303. doi: 10.1038/s41467-021-27489-w. PMID: 34911942 を見ると、 「Under our experimental condition, we did not observe the formation of SA-induced NPR1 condensates previously detected in the NPR1-GFP overexpressing seedlings after 5 mM SA treatment」 と書かれている。元の論文を見ても 1〜5 mM で作用を見ている。石濱博士らは NPR1p:NPR1-YFP、NPR1 と YFP が融合した遺伝子を導入している。プロモーターは NPR1 のものをそのまま使っているので信頼性が高い。
普通植物ホルモンはマイクロモルのオーダーで十分作用する。外部から与える場合でも 100 マイクロモルの溶液に浸せば濃い方である。「菌が感染した場ではものすごい高濃度になる」のかもしれないが、5 mM も加えてよいのだろうか。Benzoic acid でも効いたりしないのだろうか。GFP との融合タンパク質にしたせいで凝集しやすくなっているのではないか。「GFP 凝集」で検索したら、日本語でそのことについて書かれている解説が複数見つかる。サリチル酸は電子伝達を阻害する。アンカプラー活性もある。 Salicylic acid is an uncoupler and inhibitor of mitochondrial electron transport. Norman C, Howell KA, Millar AH, Whelan JM, Day DA. Plant Physiol. 2004 Jan;134(1):492-501. Epub 2003 Dec 18. PMID: 14684840 そういった副作用が大きく効いているのではないか。査読の時にそういった疑問にどうやって答えたのだろうか。
Salicylic acid inducible nucleocytoplasmic shuttling of NPR1 fusion proteins in human cells. Sadeghi F, Kumar M, Bandey IN, Li X, Roysam B, Varadarajan N. Biotechnol Bioeng. 2021 Oct 26. doi: 10.1002/bit.27966. Online ahead of print. PMID: 34698368
動物細胞には NPR1 タンパク質は存在しないし、サリチル酸は薬として有用に使われるがホルモンとして働くことはない。この論文では動物細胞でもサリチル酸が NPR1 タンパク質の核への移行を引き起こすことを発見した。NPR1 タンパク質の C-terminal transactivation (TAD) domain があれば十分であることも示された。
以前「通常時 NPR1 タンパク質は細胞質で分子間のジスルフィド結合により重合体を形成している」という説もあった。しかし「ジスルフィド結合により」ではないことが示された。
「植物の免疫応答を抑制する化合物を発見 −植物免疫応答を解明するための新たなツール−」 https://www.riken.jp/press/2021/20211215_2/index.html 理化学研究所（理研）環境資源科学研究センター植物免疫研究グループの白須賢グループディレクター、石濱伸明研究員、岡山大学学術研究院環境生命科学学域の能年義輝研究教授らのすばらしい研究 論文としても公表されている。 Oxicam-type non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit NPR1-mediated salicylic acid pathway. Ishihama N, Choi SW, Noutoshi Y, Saska I, Asai S, Takizawa K, He SY, Osada H, Shirasu K. Nat Commun. 2021 Dec 15;12(1):7303. doi: 10.1038/s41467-021-27489-w. PMID: 34911942
高分子マレイミドを用いる方法で「サリチル酸やテノキシカム処理の有無にかかわらず、NPR1中のシステイン残基は常に還元型である」ことが示された。
RNA-seq データが GSE154593 で公開されている。また Supplementary Data に処理された発現データ、遺伝子リストが公開されている。Tenoxicam という化合物がサリチル酸の作用の一部を強く抑えることが示された。その際に SA による NPR1 タンパク質の核への移行が起きなくなる。Tenoxicam 自体も様々な遺伝子の発現を変化させる。サリチル酸で転写活性化されるが Tenoxicam の影響を受けにくい遺伝子もある。
Immune gene activation by NPR and TGA transcriptional regulators in the model monocot Brachypodium distachyon. Shimizu K, Suzuki H, Uemura T, Nozawa A, Desaki Y, Hoshino R, Yoshida A, Abe H, Nishiyama M, Nishiyama C, Sawasaki T, Arimura GI. Plant J. 2022 Jan 21. doi: 10.1111/tpj.15681. Online ahead of print. PMID: 35061931
単子葉植物のモデル植物である Brachypodium distachyon には NPR1 と似た遺伝子が BdNPR1 and BdNPR2/3 とある。それぞれが別のグループに分けられ、シロイヌナズナの AtNPR1/2 and AtNPR3/4 subfamilies に対応する。BdNPR2 が持つ Arg 468 残基にサリチル酸が結合する。
どの植物種の NPR1 タンパク質にも LENRV というモチーフがあり、重要だとされている。 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/543645v1.full.pdf
MKK4/MKK5-MPK1/MPK2 cascade mediates SA-activated leaf senescence via phosphorylation of NPR1 in Arabidopsis. Zhang J など Plant Mol Biol. 2020 Mar;102(4-5):463-475. doi: 10.1007/s11103-019-00958-z. Epub 2020 Jan 8. PMID: 31916083
Dynamic ubiquitination determines transcriptional activity of the plant immune coactivator NPR1. Skelly MJ, Furniss JJ, Grey H, Wong KW, Spoel SH. Elife. 2019 Oct 7;8:e47005. doi: 10.7554/eLife.47005. PMID: 31589140
Suppression of MYC transcription activators by the immune cofactor NPR1 fine-tunes plant immune responses. Nomoto M, Skelly MJ, Itaya T, Mori T, Suzuki T, Matsushita T, Tokizawa M, Kuwata K, Mori H, Yamamoto YY, Higashiyama T, Tsukagoshi H, Spoel SH, Tada Y. Cell Rep. 2021 Dec 14;37(11):110125. doi: 10.1016/j.celrep.2021.110125. PMID: 34910911
SA によって活性化された NPR1 はジャスモン酸作用に重要な MYC2 転写因子のプロモーターに結合し、MYC2 のリプレッサーとして働く。 ジャスモン酸の作用は複雑で MYC2 を必要としない作用もある。それらの作用は NPR1 や SA で抑えられないらしい。「there are many JA-responsive genes that are not repressed by SA and/or NPR1. 」と Discussion に書かれている。
RNA-seq のデータが DRA003119、ChIP-seq of NPR1 のデータが DRA010718 で公開されている。 ChIP-seq of MYC2 and MED25（Wang et al., 2019） CRA001078 も使われている。
Salicylic acid inhibits gibberellin signaling through receptor interactions Mol Plant. 2022 Nov 7;15(11):1759-1771. doi: 10.1016/j.molp.2022.10.001. Epub 2022 Oct 4. Xiaodong Yu など PMID: 36199245
Inhibition of NPR1 activity Leads to Shoot Growth Improvement under Low-Calcium Conditions in Arabidopsis. Hashimoto S, Shikanai Y, Kusajima M, Nakamura H, Toru F, Kamiya T. Plant Cell Physiol. 2023 Aug 31:pcad096. doi: 10.1093/pcp/pcad096. Online ahead of print. PMID: 37650642
カルシウム欠乏状態ではサリチル酸応答性遺伝子の発現が増大し、サリチル酸の量も増加する。PAD4, EDS1, NPR1 が働かなくなるようにするとカルシウム欠乏による生育阻害が緩和される。しかしサリチル酸生合成酵素の変異 sid2-1 では生育を良くする作用はない。NPR1 の活性化を抑える薬剤として tenoxicam を用いた実験も行った。tenoxicam の作用は Oxicam-type non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit NPR1-mediated salicylic acid pathway. Ishihama N, Choi SW, Noutoshi Y, Saska I, Asai S, Takizawa K, He SY, Osada H, Shirasu K. Nat Commun. 2021 Dec 15;12(1):7303. doi: 10.1038/s41467-021-27489-w. PMID: 34911942 で発見された。tenoxicam を与えてもカルシウム欠乏による生育阻害が緩和される。
SA の作用に重要な因子である NPR1 が低温適応にも働いているという論文が発表されていた。 Nat Plants. 2018 Oct;4(10):811-823. doi: 10.1038/s41477-018-0254-2. Epub 2018 Sep 24. NPR1 mediates a novel regulatory pathway in cold acclimation by interacting with HSFA1 factors Ema Olate ら PMID: 30250280 https://www.researchgate.net/publication/327846429_NPR1_mediates_a_novel_regulatory_pathway_in_cold_acclimation_by_interacting_with_HSFA1_factors
この作用には SA や TGA 転写因子は関与していない。低温になると細胞質の NPR1 オリゴマーが解離して核に移行する。そこで HsfA1 という転写因子を活性化して低温耐性遺伝子を活性化する。
Mitochondrial Stress Induces Plant Resistance Through Chromatin Changes Front. Plant Sci., 22 September 2021 | https://doi.org/10.3389/fpls.2021.704964 Ana López Sánchez など という論文にも NPR1 が出てきて、SA と関係なく働くと示されている。
Organelles and phytohormones: a network of interactions in plant stress responses J Exp Bot. 2022 Nov 19; 73(21): 7165–7181. doi: 10.1093/jxb/erac384 PMCID: PMC9675595 PMID: 36169618 Andras Bittnerなど https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9675595/ この総説の「Indirect mechanisms: SA binds to proteins from different subcellular compartments」というセクションで、NPR1 と関係ないサリチル酸作用に関して書かれている。SABP3、AtGSTF2 、AtGSTF8、AtGSTF10、 chloroplastic TRX-m1、 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase、mitochondrial α-ketoglutarate dehydrogenase が出てくる。
Salicylic acid binding of mitochondrial alpha-ketoglutarate dehydrogenase E2 affects mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transport chain components and plays a role in basal defense against tobacco mosaic virus in tomato. Liao Y, Tian M, Zhang H, Li X, Wang Y, Xia X, Zhou J, Zhou Y, Yu J, Shi K, Klessig DF. New Phytol. 2015 Feb;205(3):1296-1307. doi: 10.1111/nph.13137. Epub 2014 Nov 3. PMID: 25365924
Members of the abscisic acid co-receptor PP2C protein family mediate salicylic acid-abscisic acid crosstalk Plant Direct. 2017 Nov 6;1(5):e00020. doi: 10.1002/pld3.20. eCollection 2017 Nov. Murli Manohar など PMID: 31245670 PMCID: PMC6508495
Type 2C protein phosphatases にサリチル酸が結合すると書かれている。それによって ABA の作用は打ち消される。サリチル酸を作れなくなると ABA の作用（発芽阻害）が強くなる。
Salicylic Acid Targets Protein Phosphatase 2A to Attenuate Growth in Plants. Tan S, Abas M, Verstraeten I, Glanc M, Molnár G, Hajný J, Lasák P, Petřík I, Russinova E, Petrášek J, Novák O, Pospíšil J, Friml J. Curr Biol. 2020 Feb 3;30(3):381-395.e8. doi: 10.1016/j.cub.2019.11.058. Epub 2020 Jan 16. PMID: 31956021
Glutathione Transferase Photoaffinity Labeling Displays GST Induction by Safeners and Pathogen Infection Plant Cell Physiol. 2024 Jan 19;65(1):128-141. doi: 10.1093/pcp/pcad132. Maria Font Farre など PMID: 37924215 PMCID: PMC10799724
この論文の Fig. 6 に、サリチル酸は NPR1 を介さずに GST (Glutatione S-transferase) 遺伝子の発現を誘導するという模式図がある。病原菌抵抗性を誘導する化合物としてよく知られている BTH も同じように書かれている。
PLANT MICROBIOME. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Lebeis SL, Paredes SH, Lundberg DS, Breakfield N, Gehring J, McDonald M, Malfatti S, Glavina del Rio T, Jones CD, Tringe SG, Dangl JL. Science. 2015 Aug 21;349(6250):860-4. doi: 10.1126/science.aaa8764. PMID: 26184915
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2657544/ サリチル酸の蓄積量を減らすと種子がたくさん収穫できると書かれている。
Salicylic acid deficiency in NahG transgenic lines and sid2 mutants increases seed yield in the annual plant Arabidopsis thaliana. Abreu ME, Munné-Bosch S. J Exp Bot. 2009;60(4):1261-71. doi: 10.1093/jxb/ern363. Epub 2009 Feb 2. PMID: 19188277
種子のサリチル酸蓄積量を測定したデータが Fig. 1 にある。Col-0 の種子で 300 と書いてある。SA 配糖体の分解はしていないらしい。
Salicylic acid-doped iron nano-biostimulants potentiate defense responses and suppress Fusarium wilt in watermelon. Noman M, Ahmed T, Shahid M, Mudassir Nazir M, Azizullah, Li D, Song F. J Adv Res. 2023 Jun 27:S2090-1232(23)00174-1. doi: 10.1016/j.jare.2023.06.011. PMID: 37385342
Poly(butylene succinate-co-salicylic acid) copolymers and their effect on promoting plant growth. Wang L, Zhang M, Lawson T, Kanwal A, Miao Z. R Soc Open Sci. 2019 Jul 17;6(7):190504. doi: 10.1098/rsos.190504. eCollection 2019 Jul. PMID: 31417748
Salicylic acid functionalized chitosan nanoparticle: A sustainable biostimulant for plant. Kumaraswamy RV, Kumari S, Choudhary RC, Sharma SS, Pal A, Raliya R, Biswas P, Saharan V. Int J Biol Macromol. 2019 Feb 15;123:59-69. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2018.10.202. Epub 2018 Oct 31. PMID: 30389525
Protective effects of chitosan based salicylic acid nanocomposite (CS-SA NCs) in grape (Vitis vinifera cv. Sultana) under salinity stress. Aazami MA, Maleki M, Rasouli F, Gohari G. Sci Rep. 2023 Jan 17;13(1):883. doi: 10.1038/s41598-023-27618-z. PMID: 36650251
Synthesis and characterization of chitosan-zinc-salicylic acid nanoparticles: A plant biostimulant. Sahu S, Gautam S, Singh A, Lohani P, Sharma C, Pathak P, Kumar A, Singh H. Int J Biol Macromol. 2023 Oct 22:127602. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127602. PMID: 37875188
Biostimulants はヨーロッパを中心に世界中で注目を浴びている新しい農業資材の総称であり、植物や土壌により良い生理状態をもたらす（特にストレス耐性の向上）様々な物質や微生物のことを指す。日本でも実用化が進められている。 https://www.japanbsa.com/index.html 日本バイオスティミュラント協議会
サリチル酸などの植物ホルモンと biostimulants の関係は興味深い。すでに研究が進んでいる。
Transcriptomic characterization of the response to a microalgae extract in Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum. Arvanitidou C, Ramos-González M, Romero-Losada AB, García-Gómez ME, García-González M, Romero-Campero FJ. J Sci Food Agric. 2024 Mar 4. doi: 10.1002/jsfa.13422. Online ahead of print. PMID: 38436436
この研究では微細藻類抽出物（LRMという商標）をバイオスティミュラントとして用いている。葉面散布によって処理している。 処理による遺伝子発現変化を RNAseq で測定した。PR1 などのサリチル酸誘導性遺伝子の mRNA 蓄積量が大きく増加していた。「果実数の増加、開花時期の加速、およびより高い干ばつ抵抗性」が得られると書かれている。微細藻類抽出物を与えることでサリチル酸作用の活性化と生育の促進が同時に実現できていることは興味深い。
粒子を微細化してナノスケールにすることで、普通の粒子には存在しない有用な性質が出現することがよく知られている。 リンは植物にとってとても重要な栄養成分だが鉄と結合すると不溶化して取り込まれにくい。これをナノ粒子化することで改善できるらしい。
Front. Plant Sci., 30 September 2020 https://doi.org/10.3389/fpls.2020.586470 FePO4 NPs Are an Efficient Nutritional Source for Plants: Combination of Nano-Material Properties and Metabolic Responses to Nutritional Deficiencies Davide Sega, Barbara Baldan, Anita Zamboni1* and Zeno Varanini
ナノ粒子がバイオスティミュラントとして働くことを示す論文は増加している。
The comparative effects of manganese nanoparticles and their counterparts (bulk and ionic) in Artemisia annua plants via seed priming and foliar application. Salehi H, Cheheregani Rad A, Raza A, Djalovic I, Prasad PVV. Front Plant Sci. 2023 Jan 19;13:1098772. doi: 10.3389/fpls.2022.1098772. eCollection 2022. PMID: 36743542
ビニールハウスの周囲に量子ドットを含有するフィルムを貼り付けることで紫外線を光合成に有効な光に変えるという方法がすでに行われているという一般向けニュースがあった。 https://gigazine.net/news/20200609-quantum-dots-speed-plant-growth/ https://foodtech-japan.com/2020/12/31/ubiqd/ 屋内で蛍光灯を使って栽培するなら、ランプの回りにこのフィルムを巻き付ければ紫外線を減らしながら有効な光をより多く当てられて効果があるかもしれない。
2021年にも同様な論文が出ている。 Carbon dots as light converter for plant photosynthesis: Augmenting light coverage and quantum yield effect. Li Yなど J Hazard Mater. 2021 May 15;410:124534. doi: 10.1016/j.jhazmat.2020.124534. Epub 2020 Nov 11. PMID: 33221073
2022年にも同様な論文が出ている。 Plant growth acceleration using a transparent Eu3+-painted UV-to-red conversion film Sci Rep. 2022 Oct 26;12(1):17155. doi: 10.1038/s41598-022-21427-6. Sunao Shoji など PMID: 36289255 PMCID: PMC9605945
上に書いた例のように、紫外線を可視光に変換するナノ粒子は紫外線によるダメージを低下させ光合成を促進することでバイオスティミュラントとして働くのかもしれない。
Sustainable agronomic response of carbon quantum dots on Allium sativum: Translocation, physiological responses and alternations in chromosomal aberrations Environ Res. 2022 Sep;212(Pt E):113559. doi: 10.1016/j.envres.2022.113559. Epub 2022 Jun 1. Anjali Vijeata など PMID: 35660407 P-CQD と名付けられた、パルプを原料にしたカーボン量子ドットは植物によく取り込まれ、成長が少しよくなる。
Mitigating the Trade-Off between Growth and Stress Resistance in Plants by Fungal Volatile Compounds Fumi Fukada Plant and Cell Physiology, Volume 65, Issue 2, February 2024, Pages 175–178, https://doi.org/10.1093/pcp/pcae005
GSE239841 で RNA-seq データが公開されている。
多くのバイオスティミュラントは多数の成分の複雑な混合物である。そのため作用の分析が難しい。単独または少数の成分でバイオスティミュラント作用が得られるなら研究しやすくなる。 Pure biochemicals and nanomaterials as next generation biostimulants for sustainable agriculture under abiotic stress - recent advances and future scope Plant Signal Behav. 2023 Dec 31;18(1):2290336. doi: 10.1080/15592324.2023.2290336. Epub 2023 Dec 4. Satish C Bhatla など PMID: 38050377 という総説が公開されている。
Combined Metabolomic and Transcriptomic Analysis Reveals Allantoin Enhances Drought Tolerance in Rice. Lu S, Jia Z, Meng X, Chen Y, Wang S, Fu C, Yang L, Zhou R, Wang B, Cao Y. Int J Mol Sci. 2022 Nov 16;23(22):14172. doi: 10.3390/ijms232214172. PMID: 36430648 という論文があった。アラントインに関しては、広島大学の坂本教授のグループによる優れた研究が行われている。 「植物のプリン分解 : 最近の進展と見えてきたストレス適応における役割」 植物の生長調節 53:(2) 116-123 (2018年) https://www.jstage.jst.go.jp/article/jscrp/53/2/53_116/_pdf/-char/ja 通常は量が少ない中間代謝物がストレス条件で蓄積することが、ストレスに対する対応をトリガーするという概念が示されている。
ポリアミンの重要性が示唆されている。 Priming with Small Molecule-Based Biostimulants to Improve Abiotic Stress Tolerance in Arabidopsis thaliana. Hernándiz AE, Aucique-Perez CE, Ćavar Zeljković S, Štefelová N, Salcedo Sarmiento S, Spíchal L, De Diego N. Plants (Basel). 2022 May 11;11(10):1287. doi: 10.3390/plants11101287. PMID: 35631712
メラトニンが最近注目されている。 Exogenous melatonin enhances salt stress tolerance in maize seedlings by improving antioxidant and photosynthetic capacity. Chen YE など Physiol Plant. 2018 Nov;164(3):349-363. doi: 10.1111/ppl.12737. Epub 2018 Jul 20. PMID: 29633289 メラトニンとナノ粒子を組み合わせるという論文があった。 Nanovehicles for melatonin: a new journey for agriculture. Mukherjee S, Roy S, Arnao MB. Trends Plant Sci. 2023 Dec 19:S1360-1385(23)00375-8. doi: 10.1016/j.tplants.2023.11.016. Online ahead of print. PMID: 38123438
ウレアーゼの阻害剤が作物の収量を増加させることが知られている。 Agronomic efficiency of NBPT as a urease inhibitor: A review. Cantarella H, Otto R, Soares JR, Silva AGB. J Adv Res. 2018 May 24;13:19-27. doi: 10.1016/j.jare.2018.05.008. eCollection 2018 Sep. PMID: 30094079
N-acetylglutamic acid （N-アセチルグルタミン酸）がヒストンのアセチル化を変化させてストレス耐性を高めることが発見された。N-アセチルグルタミン酸はオルニチン、アルギニン生合成の前駆体にもなる。
N-acetylglutamic acid alleviates oxidative stress based on histone acetylation in plants Front Plant Sci. 2023 May 8:14:1165646. doi: 10.3389/fpls.2023.1165646. eCollection 2023. Takeshi Hirakawa, Seia Tanno, Kazuaki Ohara PMID: 37223787 PMCID: PMC10200918
ニコチンアミドの代謝はストレス耐性を高めるという研究がある。 Overexpression of nicotinamidase 3 (NIC3) gene and the exogenous application of nicotinic acid (NA) enhance drought tolerance and increase biomass in Arabidopsis. Ahmad Z, Bashir K, Matsui A, Tanaka M, Sasaki R, Oikawa A, Hirai MY, Chaomurilege, Zu Y, Kawai-Yamada M, Rashid B, Husnain T, Seki M. Plant Mol Biol. 2021 Sep;107(1-2):63-84. doi: 10.1007/s11103-021-01179-z. Epub 2021 Aug 30. PMID: 34460049 この研究に関してすばらしい和文解説が公開されている。 ニコチン酸による植物の乾燥ストレス耐性とバイオマス生産性の向上 植物の生長調節（植物化学調節学会の機関誌） 58(1): 47-51 (2023) ザルナブ・アーマド、クラーム・バシール、戸高 大輔、関 原明 各先生方による解説
Acetate-mediated novel survival strategy against drought in plants. Kim JM, To TK, Matsui A, Tanoi K, Kobayashi NI, Matsuda F, Habu Y, Ogawa D, Sakamoto T, Matsunaga S, Bashir K, Rasheed S, Ando M, Takeda H, Kawaura K, Kusano M, Fukushima A, Endo TA, Kuromori T, Ishida J, Morosawa T, Tanaka M, Torii C, Takebayashi Y, Sakakibara H, Ogihara Y, Saito K, Shinozaki K, Devoto A, Seki M. Nat Plants. 2017 Jun 26;3:17097. doi: 10.1038/nplants.2017.97. PMID: 28650429
Ethanol Enhances High-Salinity Stress Tolerance by Detoxifying Reactive Oxygen Species in Arabidopsis thaliana and Rice Front Plant Sci. 2017 Jul 3;8:1001. Huong Mai Nguyen, Kaori Sako, Akihiro Matsui, Yuya Suzuki, Mohammad Golam Mostofa, Chien Van Ha, Maho Tanaka, Lam-Son Phan Tran, Yoshiki Habu, Motoaki Seki PMID: 28717360 PMCID: PMC5494288
γ-Aminobutyrate (GABA) Regulated Plant Defense: Mechanisms and Opportunities. Shelp BJ, Aghdam MS, Flaherty EJ. Plants (Basel). 2021 Sep 17;10(9):1939. doi: 10.3390/plants10091939. PMID: 34579473 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8468876/
Flower-inducing Effect of Benzoic and Salicylic Acids in Various Strains of Lemna paucicostata and L. minor Kaihara Sumiko , Watanabe Kazuo , Takimoto Atsushi Plant and cell physiology 22(5), 819-825, 1981
Effect of L-Pipecolic Acid on Flowering in Lemna paucicostata and Lemna gibba FUJIOKA Shozo and SAKURAI Akira Plant and cell physiology 33(4), 419-426, 1992 https://ci.nii.ac.jp/naid/110003720113/
A new aliphatic ester of hydroxysalicylic acid from fermented Carica papaya L. preparation with a potential hair growth stimulating activity. Ashour A, Amen Y, Nakagawa T, Niwa Y, Mira A, Ohnuki K, Murakami S, Imao M, Shimizu K. Nat Prod Res. 2020 Jun;34(12):1750-1755. doi: 10.1080/14786419.2018.1530231. Epub 2018 Dec 4. PMID: 30513209
植物の細胞内でイソコリスミ酸からサリチル酸が生成する反応は、どんな仕組みなのかわかっていなかった。 2019 年にそれを解決した論文が発表された。
Isochorismate-derived biosynthesis of the plant stress hormone salicylic acid. Rekhter D, Lüdke D, Ding Y, Feussner K, Zienkiewicz K, Lipka V, Wiermer M, Zhang Y, Feussner I. Science. 2019 Aug 2;365(6452):498-502. doi: 10.1126/science.aaw1720. PMID: 31371615
イソコリスミ酸は EDS5 によって細胞質へ輸送され、細胞質で PBS3 によってグルタミン酸と結合し、それが自発的に分解してサリチル酸が生成する。自発的に分解するだけでなく ENHANCED PSEUDOMONAS SUSCEPTIBILITY (EPS1) という酵素で触媒されてサリチル酸に変化することもある。
PBS3 = At5g13320 はホルモンにアミノ酸を結合する GH3 タンパク質の一員で、病原菌感染や窒素欠乏で mRNA の蓄積量が大きく増大する。
PBS3 の働きに関して書かれている論文 PBS3: a versatile player in and beyond salicylic acid biosynthesis in Arabidopsis New Phytol. 2022 Oct 20. doi: 10.1111/nph.18558. Online ahead of print. Wei Li など PMID: 36263689 Fig. 2 にカラフルな模式図がある。
Mutation of Mediator subunit CDK8 counteracts the stunted growth and salicylic acid hyper-accumulation phenotypes of an Arabidopsis MED5 mutant. Mao X, Kim JI, Wheeler MT, Heintzelman AK, Weake VM, Chapple C. New Phytol. 2019 Feb 12. doi: 10.1111/nph.15741. [Epub ahead of print] PMID: 30756399
VTC1 はアスコルビン酸生合成に関与する GDP-mannose pyrophosphorylase で GDP-mannose の生合成を触媒する。 アスコルビン酸生合成に欠陥が生じるとサリチル酸の蓄積量が増加することが知られている。
Ascorbic acid deficiency in arabidopsis induces constitutive priming that is dependent on hydrogen peroxide, salicylic acid, and the NPR1 gene. Mukherjee M, Larrimore KE, Ahmed NJ, Bedick TS, Barghouthi NT, Traw MB, Barth C. Mol Plant Microbe Interact. 2010 Mar;23(3):340-51. doi: 10.1094/MPMI-23-3-0340. PMID: 20121455
vtc1-1 はアスコルビン酸の量が野生型の3分の1に減少している。過酸化水素 H2O2 の量はその反対に有意に増加している。遊離型のサリチル酸の蓄積量はほんの少し増加しているだけだが、サリチル酸グルコシドの蓄積量は 6 倍くらいに増加している。
EDS5 は、葉緑体で合成された イソコリスミ酸 を細胞質に運ぶ輸送体
2019 年に論文が発表された。 Isochorismate-derived biosynthesis of the plant stress hormone salicylic acid. Rekhter D, Lüdke D, Ding Y, Feussner K, Zienkiewicz K, Lipka V, Wiermer M, Zhang Y, Feussner I. Science. 2019 Aug 2;365(6452):498-502. doi: 10.1126/science.aaw1720. PMID: 31371615
以前は下の論文のようにサリチル酸を輸送すると思われていたが、そうではないことが示された。
Export of salicylic acid from the chloroplast requires the multidrug and toxin extrusion-like transporter EDS5. Serrano M, Wang B, Aryal B, Garcion C, Abou-Mansour E, Heck S, Geisler M, Mauch F, Nawrath C, Métraux JP. Plant Physiol. 2013 Aug;162(4):1815-21. doi: 10.1104/pp.113.218156. Epub 2013 Jun 11. PMID: 23757404
The immune components ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 and PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 are required for cell death caused by overaccumulation of ceramides in Arabidopsis Hong-Yun Zeng など https://doi.org/10.1111/tpj.15393
EDS1 と PAD4 は共同して SA の量を増やし、その結果長鎖セラミドの量が増加する。eds1, pad4 は セラミドの蓄積量が減る。
Fig.6 に eds1, pad4, sid2(ics1) 変異体のロゼットの写真がある。普通の生育にはほとんど変化がない。見づらいグラフだが、サリチル酸グルコシドの量が減少している。LAG ONE HOMOLOGUE2 (LOH2) というセラミド合成酵素遺伝子を強く働かせることによって、サリチル酸の量が大きく増加する。 eds1, pad4, sid2(ics1) 変異はその増加を抑える。セラミドの蓄積量の増加は、サリチル酸依存的、また非依存的の両方で起きる。
セラミドキナーゼ ceramide kinase は encoded by ACCELERATED CELL DEATH5 ACD5 にコードされている。
Uncoupling salicylic acid-dependent cell death and defense-related responses from disease resistance in the Arabidopsis mutant acd5. J T Greenberg, F P Silverman, and H Liang Genetics. 2000 Sep; 156(1): 341–350. PMCID: PMC1461250 PMID: 10978297
acd5 では PR-1 遺伝子が常に強く発現している。Fig. 6 に Total サリチル酸の量が 10 倍くらい増加するという結果がある。しかし菌の感染に強くなるわけではない。
Loss of ceramide kinase in Arabidopsis impairs defenses and promotes ceramide accumulation and mitochondrial H2O2 bursts. Bi FC など Plant Cell. 2014 Aug;26(8):3449-67. doi: 10.1105/tpc.114.127050. Epub 2014 Aug 22. PMID: 25149397
acd5 ではセラミド量が増加する。セラミドは細胞内の様々なメンブレンの構成要素として働いている。セラミドキナーゼでセラミド-1-リン酸が生じる。セラミドキナーゼが働かないと防御反応が低下する。
セラミドは脂質だがリン脂質、糖脂質、ステロールとは異なり窒素原子を含んでいる。セリンが前駆体として使われる。窒素欠乏ではサリチル酸の量が増えやすいが、セラミドを合成するのに必要な窒素が不足するのかもしれない。
Aberrant accumulation of ceramides in mitochondria trigger cell death requiring autophagy in Arabidopsis J Exp Bot. 2023 Dec 9:erad456. doi: 10.1093/jxb/erad456. Online ahead of print. He-Nan Bao など PMID: 38069660 DOI: 10.1093/jxb/erad456
ACD5 はミトコンドリアで働いていると書かれている。このことはあまり注目されていなかったような気がする。セラミドが特にミトコンドリアの電子伝達系の働きに必須だったりするのだろうか。
Sphingolipid-Induced Programmed Cell Death is a Salicylic Acid and EDS1-Dependent Phenotype in Arabidopsis fatty acid hydroxylase (fah1, fah2) and ceramide synthase (loh2) Triple Mutants. König S, Gömann J, Zienkiewicz A, Zienkiewicz K, Meldau D, Herrfurth C, Feussner I. Plant Cell Physiol. 2021 Dec 15:pcab174. doi: 10.1093/pcp/pcab174. PMID: 34910213
スフィンゴ脂質はセラミドに様々な親水性の頭部 head group が結合したものである。サリチル酸と関係があることが示されている。
Ceramides regulate defense response by binding to RbohD in Arabidopsis. Jian L, Jian Y, Jian-Xin W, Ling-Yan W, Yu L, Li-Qun H, Rui-Hua W, Yao N. Plant J. 2021 Dec 16. doi: 10.1111/tpj.15639. PMID: 34919775
セラミドは、活性酸素生成酵素として有名な NADPH オキシダーゼのサブユニット RbohD に結合して防御応答を引き起こす。
Recognition of pathogen-derived sphingolipids in Arabidopsis Science. 2022 May 20;376(6595):857-860. doi: 10.1126/science.abn0650. Epub 2022 May 19. H Kato など PMID: 35587979
病原菌由来のセラミドを認識する受容体の実体を明らかにするすばらしい成果が発表された。病原菌由来セラミドは WRKY33 遺伝子のプロモーターを活性化する。病原菌由来セラミドは NEUTRAL CERAMIDASE 2 (NCER2)で切断される。その結果生じた 9-methyl–branched sphingoid base が plasma membrane lectin receptor–like kinase, RESISTANT TO DFPM-INHIBITION OF ABSCISIC ACID SIGNALING 2 (RDA2) At1g11330 で認識される。
RDA2 は、植物免疫と ABA 作用を調節する化合物 5-(3,4-dichlorophenyl)furan-2-yl]-piperidine-1-ylmethanethione (DFPM) の受容体としても見いだされている。
Chemical genetic identification of a lectin receptor kinase that transduces immune responses and interferes with abscisic acid signaling Plant J. 2019 May;98(3):492-510. doi: 10.1111/tpj.14232. Epub 2019 Mar 7. Jiyoung Parkなど PMID: 30659683 PMCID: PMC6488365
lectin receptor-like kinase は NAD+ の受容体としても見いだされている。 A lectin receptor kinase as a potential sensor for extracellular nicotinamide adenine dinucleotide in Arabidopsis thaliana Cite as: eLife 2017;6:e25474 doi: 10.7554/eLife.25474 Chenggang Wang など Research Article Jul 19, 2017
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3135961/
Fig. 3 のグラフでは、acd6 変異体の Total, 遊離型 SA のどちらも30倍くらい増加している。サリチル酸の遊離型は全体の 10 % くらいでほとんどは糖と結合していてグルコシダーゼや酸加水分解で遊離型にできる。acd6-1 は機能獲得型 (dominant) の特別な変異で、ACD6 が機能を失った変異では病原菌応答が遅くなる。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC197305/
ACD6 タンパク質は原形質膜に局在して働いている。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16297071
ACCELERATED CELL DEATH 6 Acts on Natural Leaf Senescence and Nitrogen Fluxes in Arabidopsis Front. Plant Sci., 07 January 2021 | https://doi.org/10.3389/fpls.2020.611170 Sophie Jasinski ら という論文があった。ACD6 が機能を失うとセネッセンスが遅くなり、窒素の転流が起きにくくなる。窒素源、窒素代謝がサリチル酸の量に影響を与えていると推定することができる。
ROS1-mediated decrease in DNA methylation and increase in expression of defense genes and stress response genes in Arabidopsis thaliana due to abiotic stresses BMC Plant Biol. 2022 Mar 7;22(1):104. doi: 10.1186/s12870-022-03473-4. Liping Yang など PMID: 35255815 という論文に ACD6 が出てきた。ACD6 の転写がストレスで活性化される際にはプロモーターが demethylation 脱メチル化される。それには Repressor of silencing 1 (ROS1) という因子が働いている。ROS1 は RNA-directed DNA methylation (RdDM) を阻害する。
Involvement of endogenous salicylic acid in iron-deficiency responses in Arabidopsis. Shen C, Yang Y, Liu K, Zhang L, Guo H, Sun T, Wang H. J Exp Bot. 2016 Jul;67(14):4179-93. doi: 10.1093/jxb/erw196. Epub 2016 May 21. PMID: 27208542
サリチル酸の量が少ない・増加しにくい変異体として、pad4, eds1, ics1(= sid2) が用いられている。サリチル酸を水酸化して不活性化するバクテリア由来遺伝子 NahG も用いられている。
ICS1(= sid2) は、Isochorismic acid synthase の主要なアイソフォームをコードする遺伝子で、これが機能しなくなるとサリチル酸の量が大きく減少する。
PAD4 は PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 の略で、リパーゼドメインを持つ。EDS1 タンパク質と相互作用して働く。
EDS1 は ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 の略で、PAD4 タンパク質と相互作用して働く。
植物科学：EDS1-PAD4-ADR1ノードはシロイヌナズナのパターン誘導免疫を仲介する 2021年10月21日 Nature 598, 7881 doi: 10.1038/s41586-021-03829-0 という記事があった。植物の免疫には細胞表面で病原菌を認識することで引き起こされるパターン誘導免疫（PTI）と、細胞内で病原菌由来のエフェクター分子を認識することで引き起こされる エフェクター誘導免疫（ETI）がある。二つの経路はEDS1-PAD4-ADR1ノードで収斂する。
Activation of an EDS1-mediated R-gene pathway in the snc1 mutant leads to constitutive, NPR1-independent pathogen resistance Mol Plant Microbe Interact. 2001 Oct;14(10):1131-9. doi: 10.1094/MPMI.2001.14.10.1131. X Li など PMID: 11605952
SNC1 は TIR-NB-LRR-type の病害抵抗性関連タンパク質である。NPR1 が働かない状態でも、gain-of-function 機能獲得型の変異が生じるとサリチル酸の量が大きく増加する。
Transportin-SR is required for proper splicing of resistance genes and plant immunity PLoS Genet. 2011 Jun;7(6):e1002159. doi: 10.1371/journal.pgen.1002159. Epub 2011 Jun 30. Shaohua Xu など PMID: 21738492 PMCID: PMC3128105
Figure 1 にサリチル酸の定量結果がある。snc1（機能獲得型） と npr1 の二重変異体を分析している。遊離型は 6 μg / g FW で対照の50倍くらいに増加している。配糖体を同時に測定すると 60 μg / g FW になる。PR1 が常に強く発現している。 mos14 というスプライシング関連因子の変異がさらに起きると、SNC1 のスプライシングが異常になり正常型に復帰する。
NAD はエネルギー分子、補酵素として働きストレス耐性にも必須の因子である。
NAD(P) synthesis and pyridine nucleotide cycling in plants and their potential importance in stress conditions J Exp Bot. 2006;57(8):1603-20. doi: 10.1093/jxb/erj202. Epub 2006 May 19. Graham Noctor, Guillaume Queval, Bertrand Gakière PMID: 16714307
遺伝子発現などを制御する因子としても注目されている。
More to NAD+ than meets the eye: A regulator of metabolic pools and gene expression in Arabidopsis. Gakière B, Fernie AR, Pétriacq P. Free Radic Biol Med. 2018 Jul;122:86-95. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2018.01.003. Epub 2018 Jan 5. PMID: 29309893
NAD はサリチル酸作用を活性化することが知られている。
Extracellular pyridine nucleotides induce PR gene expression and disease resistance in Arabidopsis. Zhang X, Mou Z. The Plant Journal. 2009;57:302–312. doi: 10.1111/j.1365-313X.2008.03687.x. PMID: 18798871
「Exogenous pyridine nucleotides induce Ca2+-mediated PR gene expression」 PR1 などの発現量が増大している。SA の量も大きく増加している (Fig. 4)。
Inducible NAD overproduction in Arabidopsis alters metabolic pools and gene expression correlated with increased salicylate content and resistance to Pst-AvrRpm1 Plant J. 2012 May;70(4):650-65. doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.04920.x. Epub 2012 Mar 8. Pierre Pétriacq などPMID: 22268572
NAD Acts as an Integral Regulator of Multiple Defense Layers. Petriacq P, Ton J, Patrit O, Tcherkez G, Gakiere B. Plant Physiol. 2016 Nov;172(3):1465-1479. Epub 2016 Sep 12. PMID: 27621425
Fig. S1 に、NAD の量が増えるとそれと相関してサリチル酸 (SA) の量も増えるというデータがある。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5100754/bin/supp_pp.16.00780_PP2016-00780DR1_Supplemental_Figure_S1.pdf
Knockdown of Quinolinate Phosphoribosyltransferase Results in Decreased Salicylic Acid-Mediated Pathogen Resistance in Arabidopsis thaliana Int J Mol Sci. 2021 Aug 6;22(16):8484. doi: 10.3390/ijms22168484. Shengchun Li など PMID: 34445186 PMCID: PMC8395217 DOI: 10.3390/ijms22168484 NAD の de novo 生合成酵素の一つ Quinolinate phosphoribosyltransferase (QPRT) をノックダウンするとサリチル酸による病原菌抵抗性が低下する。 これは NAD が減少するがキノリン酸が増えている？
Fig.3 では PR1 の mRNA量が減少している。SA の量も減少している。GSTU24, OXI1 という酸化ストレスに応答する遺伝子の mRNA 量が減少している。AOX1a, FER1 の mRNA量も減少している。
Characterization of Arabidopsis thaliana SufE2 and SufE3: Functions in chloroplast iron-sulfur cluster assembly and Nad synthesis. Murthy U.M.N., Ollagnier-de-Choudens S., Sanakis Y., Abdel-Ghany S.E., Rousset C., Ye H., Fontecave M., Pilon-Smits E.A.H., Pilon M. J. Biol. Chem. 2007;282:18254–18264. doi: 10.1074/jbc.M701428200.
Quinolinate synthase (QS) には SufE domain が存在する。
The Arabidopsis onset of leaf death5 Mutation of Quinolinate Synthase Affects Nicotinamide Adenine Dinucleotide Biosynthesis and Causes Early Ageing Plant Cell. 2008 Oct; 20(10): 2909–2925. doi: 10.1105/tpc.107.056341 PMCID: PMC2590718 PMID: 18978034
NAD de novo 生合成前駆体 quinolinate (QPRT の一つ前) を合成する酵素 (QS) の変異でセネッセンスが早く起きる。これはキノリン酸が減っている？ キノリン酸は神経毒性があるということから動物で研究が進んでいる。植物でもシグナルとして働くのかもしれない。
NAD は de novo 新規合成されるだけでなく NAD が代謝されて生じる ニコチンアミドからサルベージ合成される経路もある。ニコチンアミドからニコチン酸を生成する反応を触媒する酵素をコードする NIC1 の変異体について報告されている。
Nicotinamidase participates in the salvage pathway of NAD biosynthesis in Arabidopsis Plant J. 2007 Mar;49(6):1020-9. doi:10.1111/j.1365-313X.2006.03013.x. Guodong Wang, Eran Pichersky PMID: 17335512
nic1 変異体は 「decreased pools of pyridine nucleotides in many tissues and is hypersensitive to salt and ABA treatments」という性質を示す。ニコチンアミドの量が増加する。
Multiple pathways regulating the calorie restriction response in yeast J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2011 Feb;66(2):163-9. doi: 10.1093/gerona/glq165. Epub 2010 Nov 15. Ofer Rahat など PMID: 21081478
酵母のニコチンアミダーゼ PNC1 の変異体の研究が行われている。酵母では NADH の減少は発酵を抑制し、好気呼吸を増加させる。強い炭素源枯渇では PNC1 の発現量が増大する。弱い炭素源枯渇では PNC1 は誘導されないが鉄輸送が増加し、好気呼吸が活性化する。その際に NADH は減少する。
NAD+ はチアミン生合成の前駆体の一つである。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7443482/
NADH はミトコンドリア電子伝達系に電子を供給して ATP 合成のためのエネルギー源になる。また様々な酸化還元反応の補酵素になる。それだけでなく XDH によって NADH -> NAD+ に酸化されると同時に酸素に電子を渡して活性酸素を生成する。 Dual and Opposing Roles of Xanthine Dehydrogenase in Defense-Associated Reactive Oxygen Species Metabolism in Arabidopsis Plant Cell. 2016 May;28(5):1108-26. doi: 10.1105/tpc.15.00880. Epub 2016 May 5. Xianfeng Maら PMID: 27152019 PMCID: PMC4904670 DOI: 10.1105/tpc.15.00880
NAD+ は アブシジン酸の量も制御するという論文があった。 Plant J. 2020 Dec;104(5):1149-1168. doi: 10.1111/tpj.15000. Epub 2020 Nov 24. Changes in intracellular NAD status affect stomatal development in an abscisic acid-dependent manner Elias Feitosa-Araujo ら PMID: 32996222 DOI: 10.1111/tpj.15000
NAD をシグナルとして感知するレセプターキナーゼに関する論文があった。
Extracellular pyridine nucleotides trigger plant systemic immunity through a lectin receptor kinase/BAK1 complex. Wang C, Huang X, Li Q, Zhang Y, Li JL, Mou Z. Nat Commun. 2019 Oct 22;10(1):4810. doi: 10.1038/s41467-019-12781-7. PMID: 31641112 At5g01540 が LECRKA4.1 lectin receptor kinase a4.1 マイクロアレイのデータが GSE121886 で公開されている。
A lectin receptor kinase as a potential sensor for extracellular nicotinamide adenine dinucleotide in Arabidopsis thaliana Cite as: eLife 2017;6:e25474 doi: 10.7554/eLife.25474 Chenggang Wang など Research Article Jul 19, 2017
マイクロアレイのデータが GSE76568 で公開されている。SA 誘導性遺伝子の発現量が大きく増加している。 At5g60280 Concanavalin A-like lectin protein kinase family protein が、NAD+ のレセプターとして働いていることが発見された。この遺伝子自体もサリチル酸で誘導される。
NAD の関連化合物である NMN Nicotinamide mononucleotide も、SA 応答を引き起こす。マイクロアレイのデータが GSE93079 で公開されている。
Nicotinamide mononucleotide and related metabolites induce disease resistance against fungal phytopathogens in Arabidopsis and barley Sci Rep. 2017 Jul 25;7(1):6389. doi: 10.1038/s41598-017-06048-8. Akihiro Miwa, Yuji Sawada, Daisuke Tamaoki, Masami Yokota Hirai, Makoto Kimura, Kazuhiro Sato, Takumi Nishiuchi PMID: 28743869 PMCID: PMC5526872
NAD 生合成経路の一員であるニコチン酸はメチル化や配糖体化などの修飾を受ける。またニコチン酸から生成する含窒素二次代謝産物にはニコチンがある。
MeNA, Controlled by Reversible Methylation of Nicotinate, Is an NAD Precursor that Undergoes Long-Distance Transport in Arabidopsis Mol Plant. 2018 Oct 8;11(10):1264-1277. doi: 10.1016/j.molp.2018.07.003. Epub 2018 Jul 25. Ranran Wu など PMID: 30055263
この論文では NAD de novo 生合成酵素がノックアウトされた変異体が使われている。培地にニコチン酸を加えると生育が回復する。
Identification and receptor mechanism of TIR-catalyzed small molecules in plant immunity SHIJIA HUANG など SCIENCE 7 Jul 2022 Vol 377, Issue 6605 DOI: 10.1126/science.abq3297
TIR domain をもつタンパク質は nicotinamide adenine dinucleotide hydrolases (NADases) 活性によって、 2ʹ-(5ʹʹ-phosphoribosyl)-5′-adenosine diphosphate (pRib-ADP), pRib-AMP を生成する。pRib-ADP 等が EDS1-PAD4 and EDS1-SAG101 を活性化する。
TIR-catalyzed ADP-ribosylation reactions produce signaling molecules for plant immunity AOLIN JIA など SCIENCE7 Jul 2022 Vol 377, Issue 6605 DOI: 10.1126/science.abq8180
さらに NAD と ATP が同時に基質になることもある。その場合は ADPr-ATP and di-ADPR が生成する。これらも EDS1 に働いて、この場合は cell death を引き起こす。
TIR ドメインに関するとてもよい総説があった。 Shared TIR enzymatic functions regulate cell death and immunity across the tree of life Kow Essuman など Science 7 Jul 2022 Vol 377, Issue 6605 DOI: 10.1126/science.abo0001
NLR locus-mediated trade-off between abiotic and biotic stress adaptation in Arabidopsis. Ariga H, Katori T, Tsuchimatsu T, Hirase T, Tajima Y, Parker JE, Alcázar R, Koornneef M, Hoekenga O, Lipka AE, Gore MA, Sakakibara H, Kojima M, Kobayashi Y, Iuchi S, Kobayashi M, Shinozaki K, Sakata Y, Hayashi T, Saijo Y, Taji T. Nat Plants. 2017 May 26;3:17072. doi: 10.1038/nplants.2017.72. PMID: 28548656
https://www.jstage.jst.go.jp/article/jals/28/2/28_61/_article/-char/ja/ 「植物の環境適応の過程で「水を取るか，病害菌から身を守るか」決め手となった仕組みを解明」 太治先生による解説
この研究では、まずやや弱い塩ストレスを与える（馴化処理）とその後強い浸透圧ストレスに耐える力が強くなるという実験系を確立している。多くの系統のシロイヌナズナの芽生えで、耐える力を比較した結果 Bu-5, Bur-0 は強かった。一方よく研究に使われる Col 系統は弱かった。
系統間の違いを利用して ACQOS が発見された。これは Disease resistance protein (TIR-NBS-LRR class) と注釈されている。ACQOS は Col では強く働いている。それによって塩、浸透圧ストレス時に SA 応答、また SA と関係ない病原菌感染応答が起きて、それらがかえって有害に働き芽生えは枯れやすくなる。ACQOS が働いていない系統 Bu-5, Bur-0 は塩による馴化処理によって SA 応答は起きない。そのため浸透圧ストレスに対する耐性が大きく高まる。SA の作用は ABA 作用を打ち消すことがある。
TIR-NLR による応答は高い温度では弱くなることが知られている。そのことを利用して 22 ℃と 28℃で比較している。
UniProt によると https://www.uniprot.org/uniprotkb/A0A1Y1BZS1/entry ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 活性を示す。 H2O + NAD+ = ADP-D-ribose + H+ + nicotinamide
NAD+ を分解してニコチンアミドを生成する活性がある。NAD+ はこの文章の上の方にも書いたように SA と関係がある。ニコチンアミドの代謝はストレス耐性を高めるという研究がある。 Overexpression of nicotinamidase 3 (NIC3) gene and the exogenous application of nicotinic acid (NA) enhance drought tolerance and increase biomass in Arabidopsis. Ahmad Z, Bashir K, Matsui A, Tanaka M, Sasaki R, Oikawa A, Hirai MY, Chaomurilege, Zu Y, Kawai-Yamada M, Rashid B, Husnain T, Seki M. Plant Mol Biol. 2021 Sep;107(1-2):63-84. doi: 10.1007/s11103-021-01179-z. Epub 2021 Aug 30. PMID: 34460049 この研究に関してすばらしい和文解説が公開されている。 ニコチン酸による植物の乾燥ストレス耐性とバイオマス生産性の向上 植物の生長調節（植物化学調節学会の機関誌） 58(1): 47-51 (2023) ザルナブ・アーマド、クラーム・バシール、戸高 大輔、関 原明 各先生方による解説
上に書いたように日本のグループによるすばらしい研究によって ACQOS 遺伝子が発見された。ACQOS は Col 系統では強く働いているが Bu-5, Bur-0 では働いていない。UniProt には遺伝子多型のデータも掲載されている。自然免疫のセンサータンパク質、レクチン様ドメインを持つプロテインキナーゼなどは品種間の多様性が高く ORF にストップコドンが出現していることが多く見られる。上に書いた At5g01540 LECRKA4.1 lectin receptor kinase a4.1 でもそうだった。
Ammonium and nitric oxide condition the establishment of Arabidopsis Ler/Kas-2 immune-related hybrid incompatibility. Atanasov KE, Díaz-Narváez LC, Alcázar R. Planta. 2022 Sep 10;256(4):76. doi: 10.1007/s00425-022-03990-4. PMID: 36087170
Ler 系統と Kas-2 系統のハイブリッドは、低温でサリチル酸作用が構成的に高まり成長が悪くなる。 アンモニウムイオンを多量に含む培地では生育が回復し、サリチル酸作用も起きなくなる。
The ammonium/nitrate ratio is an input signal in the temperature-modulated, SNC1-mediated and EDS1-dependent autoimmunity of nudt6-2 nudt7. Wang H, Lu Y, Liu P, Wen W, Zhang J, Ge X, Xia Y. Plant J. 2013 Jan;73(2):262-75. doi: 10.1111/tpj.12032. Epub 2012 Nov 8. PMID: 23004358
でも、アンモニウムイオンと免疫反応に関係があることが示されている。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4981494/
シロイヌナズナの AtNUDT7 は Nudix protein の一種で、病原菌応答と関連することで見いだされた。Nudix は Nucleoside diphosphate-linked moiety X の略で、Nudix hydrolase は NAD+, NADH などを分解する。
小川、重岡、吉村 各先生方による解説が公開されている。Journal of Japanese Biochemical Society 88(6): 752-755 (2016) doi:10.14952/SEIKAGAKU.2016.880752 植物 Nudix hydrolaseファミリーの機能解析の進展 細胞内 GDP-D-マンノースおよび NADH 代謝制御の新たな役割 https://seikagaku.jbsoc.or.jp/10.14952/SEIKAGAKU.2016.880752/data/index.html Atnudt7 knockout mutants ではサリチル酸の蓄積量が増加する。これには NAD+, NADH の量の変化は関わっていないことが示されている。
The importance of thiamine (vitamin B1) in plant health: From crop yield to biofortification Journal of Biological Chemistry Volume 295, Issue 34, 21 August 2020, Pages 12002-12013 に、NUDIX が出てくる。チアミン生合成の一部に関わっている。
Cytosolic geraniol and citronellol biosynthesis require a Nudix hydrolase in rose‐scented geranium (Pelargonium graveolens) Matthew E. Bergman, Mridula Bhardwaj, Michael A. Phillips Version of Record online: 07 June 2021 という論文があった。テルペノイド生合成に Nudix hydrolase が関わっていることがわかってきたと書かれている。
Ogawa T, Muramoto K, Takada R, Nakagawa S et al. Modulation of NADH Levels by Arabidopsis Nudix Hydrolases, AtNUDX6 and 7, and the Respective Proteins Themselves Play Distinct Roles in the Regulation of Various Cellular Responses Involved in Biotic/Abiotic Stresses. Plant Cell Physiol 2016 Jun;57(6):1295-308. PMID: 27095738 という論文が発表されている。マイクロアレイデータ GSE74346 も公開されている。nudix6, nudix7 単独のノックアウトでは発現変化は小さいが、両方同時にノックアウトすると PR-1 などが強く発現している。
植物はビタミンを全部自前で合成しなければならない。それには複雑な生合成経路と高いコストが必要であり高度に調節されている。
Does Abiotic Stress Cause Functional B Vitamin Deficiency in Plants? Hanson AD, Beaudoin GA, McCarty DR, Gregory JF 3rd. Plant Physiol. 2016 Dec;172(4):2082-2097. Review. PMID: 27807106 高温、低温ストレスによる生育の抑制がビタミンを与えることで回復する例が紹介されている。 ホルモン研究に比べて植物のビタミン生合成の研究は見落とされているがそれだけまだ研究の余地が大きいと書かれている。
B vitamin supply in plants and humans: the importance of vitamer homeostasis Zeguang Liu, Peter Farkas, Kai Wang, Morgan-Océane Kohli, Teresa B. Fitzpatrick Pages: 662-682 | First Published: 08 June 2022 という論文があった。
Plant Physiol. 2005 Jul;138(3):1505-15. Vitamin B1 functions as an activator of plant disease resistance Pyung Ahn ら PMID: 15980201 PMCID: PMC1176421 DOI: 10.1104/pp.104.058693
ビタミンB1（チアミン）を与えると代表的なサリチル酸誘導性遺伝子 PR-1 の mRNA量が増加して抗菌性が高くなる。サリチル酸の量は測定されていない。
Vitamin B1-induced priming is dependent on hydrogen peroxide and the NPR1 gene in Arabidopsis. Ahn IP, Kim S, Lee YH, Suh SC. Plant Physiol. 2007 Feb;143(2):838-48. doi: 10.1104/pp.106.092627. Epub 2006 Dec 8. PMID: 17158583
チアミンは PR-1 遺伝子の発現を一過性に誘導する。その後元に戻る。戻った状態に菌が感染すると、PR-1 遺伝子発現などの防御応答がすばやく、強くなるというプライミング作用を示している。この作用は npr1 変異体では見られなくなる。サリチル酸の量は測定されていない。
Thiamine modulates metabolism of the phenylpropanoid pathway leading to enhanced resistance to Plasmopara viticola in grapevine BMC Plant Biol. 2013; 13: 31. Published online 2013 Feb 26. doi: 10.1186/1471-2229-13-31 PMCID: PMC3599452
ブドウを実験材料にしている。チアミン処理でスチルベン、リグニン、フラボノイドが増加する。サリチル酸は測定されていない。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7443482/ の Fig. 3 を見ると、チアミンは葉緑体で生合成され細胞質でチアミン二リン酸になる。ミトコンドリアへは輸送体で運ばれ PDH などの補酵素として働く。葉緑体へはチアミン二リン酸が戻されて様々な酵素の補酵素として働く。細胞質にもチアミン二リン酸を補酵素とする酵素がある。核では調節因子として働く。生合成だけでなく輸送、分配も、特にチアミン量が少なくなった際に重要になるような仕組みになっている。
動物で、アスピリン（アセチルサリチル酸）をチアミン欠乏ラットに与えるとミトコンドリア PDH （チアミンを補酵素とする酵素）によるピルビン酸の利用が悪くなるという報告がある。
Mode of action of aspirin. Effect of dietary aspirin on mitochondrial pyruvate metabolism in normal and thiamine-deficient rats J Biol Chem. 1971 Mar 25;246(6):1618-22. M A Mehlman, R B Tobin, M M Madappally, H K Hahn PMID: 5547697
共生菌によってチアミンの量を増やすという論文があった。 Enhancement of Thiamine Biosynthesis in Oil Palm Seedlings by Colonization of Endophytic Fungus Hendersonia toruloidea Amirah N. Kamarudin, Kok S. Lai, Dhilia U. Lamasudin, Abu S. Idris, Zetty N. Balia Yusof Front Plant Sci. 2017; 8: 1799. Published online 2017 Oct 17. doi: 10.3389/fpls.2017.01799 PMCID: PMC5651052
下の方に MEP pathway の変異体 ceh1 が出てくる。MEP経路の最初の段階で律速段階でもある DXS はチアミンを補酵素とする。変異体が見つかっている。
The thiamin requiring 3 (th3) mutation of Arabidopsis 5-deoxyxyulose-phosphate synthase 1 (DXS1) highlights how the thiamin economy regulates the MEP pathway Jaya Joshi, など https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.721391/full
チアミンを補酵素とする酵素の一つにピルビン酸デカルボキシラーゼがある。この酵素が働くとピルビン酸からアセトアルデヒドが生じる。嫌気呼吸ではアセトアルデヒドはエタノールや乳酸になるが、植物にはアセトアルデヒドから酢酸が生じる経路も働いている。酢酸はアセチル CoA の前駆体になり乾燥耐性を高める働きがある。 The modulation of acetic acid pathway genes in Arabidopsis improves survival under drought stress. Rasheed S, Bashir K, Kim JM, Ando M et al. Sci Rep 2018 May 18;8(1):7831. PMID: 29777132
Balancing of B6 Vitamers Is Essential for Plant Development and Metabolism in Arabidopsis. Colinas M, Eisenhut M, Tohge T, Pesquera M, Fernie AR, Weber AP, Fitzpatrick TB. Plant Cell. 2016 Feb;28(2):439-53. doi: 10.1105/tpc.15.01033. Epub 2016 Feb 8. PMID: 26858304
この変異体はアンモニウムイオンが培地に含まれないと生育が（少し）悪くなる。 Fig.5 にアミノ酸、有機酸、糖の量を測定したグラフがある。倍率しか出されていないが、サリチル酸の蓄積量が大きく増加している。
ビタミン B6 の一種であるピリドキサールリン酸 (PLP) は、様々なアミノ酸代謝酵素の補酵素として働く。 またホルモン生合成にも関わっている。 https://www.uniprot.org/uniprot/Q9C5X8 ABA3 は補酵素としてピリドキサールリン酸を用いる。 https://www.uniprot.org/uniprot/P18485 ACC 合成酵素は補酵素としてピリドキサールリン酸を用いる。 https://www.uniprot.org/uniprot/Q9S7N2 トリプトファンアミノトランスフェラーゼは補酵素としてピリドキサールリン酸を用いる。理屈的にはピリドキサールリン酸が減ると ABA とエチレンとインドール酢酸ができにくくなることになる。実際にどれくらい影響するかは調べないとわからない。すでにビタミンB6 とホルモンに関する論文があった。サリチル酸は出てこない。
Consequences of a Deficit in Vitamin B6 Biosynthesis de Novo for Hormone Homeostasis and Root Development in Arabidopsis Plant Physiol. 2015 Jan; 167(1): 102–117. Published online 2014 Dec 4. doi: 10.1104/pp.114.247767 PMCID: PMC4281000 PMID: 25475669 Svetlana Boychevaら
マイクロアレイのデータ GSE71312 がある。PDX1 をコードする遺伝子の一つ PDX1.3 の knock out 変異を調べている。葉ではアブシジン酸がよく効いているという結果になっている。間接的に根が水を吸いにくくなったのかもしれない。
At3g16050 A37 ATPDX1.2 PDX1.2 pyridoxine biosynthesis 1.2 は、熱ストレスを受けると mRNA の蓄積量が大きく増加することが複数のマイクロアレイのデータで示されている。
At5g49970 = PDX3 に関する論文が発表された。28℃での育成を試している。サリチル酸作用 NPR1 との関連が書かれている。
PYRIDOX(AM)INE 5’-PHOSPHATE OXIDASE3 of Arabidopsis thaliana maintains carbon/nitrogen balance in distinct environmental conditions Plant Physiol. 2023 Jul 15;kiad411. doi: 10.1093/plphys/kiad411. Priscille Steensma など PMID: 37453131
この論文には「One other feature of pdx3 lines is that they are morphologically similar to wildtype plants when grown at 28 °C (Colinas and Fitzpatrick 2016). I」 と書かれている。22 度では pdx3 変異体に含まれるサリチル酸の量は野生型の 2〜3 倍に増加している。28度ではサリチル酸の量が野生型と変化しなくなっている (Fig. 7A)。
PLP の欠乏による窒素、炭素代謝のバランスの変動（相対的にアミノ酸が増加して有機酸が不足する）が、間接的にサリチル酸応答を活性化すると想像した図面が Fig. 9 に書かれている。
動物で、ビタミン B6 欠乏の影響を調べた論文があった。重要な分子である SAM, SAH の量が変化する。
Effect of vitamin B6 deficiency on the synthesis and accumulation of S-adenosylhomocysteine and S-adenosylmethionine in rat tissues. Nguyen TT, Hayakawa T, Tsuge H. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2001 Jun;47(3):188-94. doi: 10.3177/jnsv.47.188. PMID: 11575573
Folic acid induces salicylic acid-dependent immunity in Arabidopsis and enhances susceptibility to Alternaria brassicicola. Wittek F など Mol Plant Pathol. 2015 Aug;16(6):616-22. doi: 10.1111/mpp.12216. Epub 2014 Dec 15. PMID: 25348251
これもビタミンと関係がある。Folic acid またはその前駆体 7,8‐dihydroneopterin (DHN) を与えると PR-1 の発現量が増加する。この論文に folic acid の生合成経路が図示されている。とても複雑であり細胞質、葉緑体、ミトコンドリアが関わっている。葉緑体ではコリスミ酸から分岐して p-aminobenzoate (PABA) が生成する。コリスミ酸はサリチル酸の前駆体でもある。
植物で葉酸が補酵素として働いている過程、反応を並べてみる。
Folate Metabolism Interferes with Plant Immunity through 1C Methionine Synthase-Directed Genome-wide DNA Methylation Enhancement. González B, Vera P. Mol Plant. 2019 Sep 2;12(9):1227-1242. doi: 10.1016/j.molp.2019.04.013. Epub 2019 May 9. PMID: 31077872
この論文では、病原菌感染で活性化する Ep5C プロモーターを活性化する Sulfonamides タイプの化合物を見つけている。これらはすべて p-aminobenzoic acid （葉酸の生合成前駆体の一つ）に相当する部分構造を持ち葉酸の生合成を阻害する。SA による PR1 の活性化も強く起きるようになった。SA に依存しない抵抗性強化も起きていた。
SDZ という化合物を選んで分析した。SDZ による効果は葉酸 folate を加えると打ち消された。
葉酸を加えると抵抗性誘導が弱くなった。葉酸を用いるメチオニン合成酵素 METS1 を強く発現させることでも抵抗性誘導が弱くなった。METS1 が強く発現した植物ではゲノム DNA 全体のメチル化が促進されていた。菌が感染すると脱メチル化が促進された。 葉酸、メチオニンを通じた DNA のメチル化の変化が大切なことが示された。
葉酸生合成の阻害剤として Sulfonamides は多くの研究で使われている。
Sulfanilamide Regulates Flowering Time through Expression of the Circadian Clock Gene LUX. Hirohata A, Yamatsuta Y, Ogawa K, Kubota A, Suzuki T, Shimizu H, Kanesaka Y, Takahashi N, Endo M. Plant Cell Physiol. 2022 May 16;63(5):649-657. doi: 10.1093/pcp/pcac027. PMID: 35238923
この論文では花成のタイミングを見るために、ポットに種まきして低温処理3日後22℃で育成したシロイヌナズナに定期的に 500 ml の処理液（12 mM の sulfanilamide, 葉酸生合成の阻害剤）を与えている。処理日は 5, 9, 12, 16, 19, 23, 26, 30, 33, 37, 40, 44, 47 日目と書かれている。この条件では花成が抑制され遅くなるが生育は全く悪くなっていない。
RNA-seq データが DRA011330 で公開されている。
ssi は for suppressor of SA insensitivity の略で、ssi1 という変異体もある（ 論文： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9927638/ PMC144168 など）。PubMed を見ると、ssi1 に関する論文は 2003 年を最後として全く出ていない。ssi2 に関する論文は最近減っているが一年に一つぐらい出ている。
A recessive mutation in the Arabidopsis SSI2 gene confers SA- and NPR1-independent expression of PR genes and resistance against bacterial and oomycete pathogens. Shah J, Kachroo P, Nandi A, Klessig DF. Plant J. 2001 Mar;25(5):563-74. doi: 10.1046/j.1365-313x.2001.00992.x. PMID: 11309146
ssi2 変異体では PR1, BGL2 遺伝子が強く発現している。これらの発現は npr1-5 と二重変異になってもあまり低下しない。
Plastidial fatty acid signaling modulates salicylic acid- and jasmonic acid-mediated defense pathways in the Arabidopsis ssi2 mutant. Kachroo A, Lapchyk L, Fukushige H, Hildebrand D, Klessig D, Kachroo P. Plant Cell. 2003 Dec;15(12):2952-65. Epub 2003 Nov 13. PMID: 14615603
Plant Physiol. 2005 Dec; 139(4): 1717–1735. doi: 10.1104/pp.105.071662 PMCID: PMC1310554 PMID: 16306139 Role of Salicylic Acid and Fatty Acid Desaturation Pathways in ssi2-Mediated Signaling
SSI2 は葉緑体で脂肪酸合成に働く stearoyl-ACP desaturase (S-ACP-DES) をコードしている。電子供与体として還元型フェレドキシンを利用する。この遺伝子が失活すると 18:1 脂肪酸の量が減少し、サリチル酸の蓄積量が増大する。
Oleic acid levels regulated by glycerolipid metabolism modulate defense gene expression in Arabidopsis Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Apr 6;101(14):5152-7. PMID: 15044700 PMCID: PMC387389 DOI: 10.1073/pnas.0401315101 では、ssi2 変異体は plastidial glycerol-3-phosphate (G3P) acyltransferase と二重変異体になることで Glycerol-3-phosphate の量が減少して 18:1 脂肪酸がリン脂質に取り込まれにくくなり、その結果性質が野生型に近くなると書かれている。G3P dehydrogenase が変異することでも ssi2 の性質が野生型に近くなる。
葉緑体内の 18:1 脂肪酸の量を回復させる二重変異体ではサリチル酸の量が増大しにくくなる。脂質不飽和化酵素である FAD7, FAD8 は不飽和結合を三個持つ脂質の合成に働く。これらと ssi2 の三重変異体でもサリチル酸の量は増大しにくくなる。
GEO Datasets に GSE36797 というデータがある。
https://www.uniprot.org/uniprotkb/F4IS32/entry によると、SSI2 は反応にフェレドキシンを用いる。フェレドキシンは補酵素として 2Fe-2S を保持している。
葉緑体で働くイソプレノイド生合成経路 MEP経路の最初の段階で律速段階でもある DXS はチアミンを補酵素とする。th3 は DXS が変異した変異体である。
The thiamin requiring 3 (th3) mutation of Arabidopsis 5-deoxyxyulose-phosphate synthase 1 (DXS1) highlights how the thiamin economy regulates the MEP pathway Jaya Joshi, など https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.721391/full 弱い変異で、チアミンを与えなくても生育するが野生型よりもクロロフィルが薄い。チアミンを与えると回復する。
この変異体では、PR-1 などの SA 応答性遺伝子の発現量が増大している（Table S1 up-regulated genes）。変異が MEP 経路に「knock on 効果」を与えていると考察している。
RNAseq データが公開されている。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ を プロジェクト番号 PRJNA368967 で検索する。出てくる Bioproject のデータ(129)のリンクをたどると、「th3 transcriptome」のデータが 6 つ（th3 と WT(Ler)）出てくる。それ以外にも乾燥ストレス、塩ストレス、オゾンストレスなどのデータがたくさん並んでいる。thiamin transcriptome 1, 2, 3 というのもある。この研究グループはビタミンがストレス耐性に果たす役割を研究している。
DXS タンパク質の分解による調節に関する論文があった。葉緑体内で凝集体を形成する。
Differential Subplastidial Localization and Turnover of Enzymes Involved in Isoprenoid Biosynthesis in Chloroplasts. Perello C, Llamas E, Burlat V, Ortiz-Alcaide M, Phillips MA, Pulido P, Rodriguez-Concepcion M. PLoS One. 2016 Feb 26;11(2):e0150539. doi: 10.1371/journal.pone.0150539. eCollection 2016. PMID: 26919668
Interference with plastome gene expression and Clp protease activity in Arabidopsis triggers a chloroplast unfolded protein response to restore protein homeostasis. Llamas E, Pulido P, Rodriguez-Concepcion M. PLoS Genet. 2017 Sep 22;13(9):e1007022. doi: 10.1371/journal.pgen.1007022. eCollection 2017 Sep. PMID: 28937985
Arabidopsis PII Proteins Form Characteristic Foci in Chloroplasts Indicating Novel Properties in Protein Interaction and Degradation. Krieger N, Pastryk KF, Forchhammer K, Kolukisaoglu Ü. Int J Mol Sci. 2021 Nov 23;22(23):12666. doi: 10.3390/ijms222312666. PMID: 34884470
PII タンパク質は細菌、古細菌、および植物の葉緑体に存在する調節タンパク質である。PII タンパク質は 2−OG やグルタミンと相互作用して炭素・窒素バランスのセンサーとして働く。細菌の PII ホモログは GlnB という名前で呼ばれる。しかしシロイヌナズナなどのアブラナ科の PII タンパク質は特殊で、グルタミンと結合しないことが知られている。これまで PII タンパク質で制御される酵素としてオルニチン、アルギニン生合成系の酵素である NAGK At3g57560 が見つかっていた。 また PII タンパク質はアセチルCoAカルボキシラーゼと相互作用して脂肪酸合成を抑制する。
Krieger N らの論文では、シロイヌナズナの葉緑体では PII タンパク質 At4g01900 が凝集体を形成していることを発見した。 DXS, DXR も凝集体を形成することが報告されていた。そこで調べてみたところ、 PII タンパク質と相互作用することが明らかにされた（証拠となるデータは少ないが）。
Calmodulin-binding protein 60 G (CBP60G) は DNA 結合タンパク質で転写を促進する。 https://www.uniprot.org/uniprot/F4K2R6 ICS1 や PR1 などのサリチル酸関連遺伝子の転写を促進する。芽生えではアブシジン酸の作用にも関与して過剰発現するとアブシジン酸が強く効く (PubMed: 22466450)。窒素欠乏などで発現が促進される。 SAR DEFICIENT 1 (SARD1 At1g73805) は CBP60G と同じような転写因子で同様に働く。これはサリチル酸で発現が促進される。
すばらしい共発現データベース ATTED-II によると、CBP60G は SARD1, PBS3 などど高い発現相関がある。
Calmodulin-binding protein CBP60g is a positive regulator of both disease resistance and drought tolerance in Arabidopsis Plant Cell Rep. 2012 Jul;31(7):1269-81. doi: 10.1007/s00299-012-1247-7. Epub 2012 Mar 31. Dongli Wan など PMID: 22466450 によると、 CBP60G が変異すると Pst DC3000 による PR1, PR2 の発現誘導が弱くなる（1/3 くらい残っている）。過剰に発現すると、それだけでは PR1, PR2 の mRNA 量は増加しないが、Pst DC3000 が感染した際の PR1, PR2 の mRNA 量の増加が早く、強く起きている (Fig. 1E)。CBP60G が強く働くことでプライミング作用が起きている。
ホルモンの作用は様々な環境からのストレスと相互作用する。
上に書いた Calmodulin-binding protein CBP60g is a positive regulator of both disease resistance and drought tolerance in Arabidopsis Plant Cell Rep. 2012 Jul;31(7):1269-81. doi: 10.1007/s00299-012-1247-7. Epub 2012 Mar 31. Dongli Wan など PMID: 22466450 によると、CBP60G を過剰に発現した植物体では、水やりを止めて乾燥ストレスを与えるテストで野生型よりもずっとしおれにくい（Fig. 6）。野生型では短時間の乾燥処理で ICS1 遺伝子の発現に変化はないが、CBP60G を過剰に発現した植物では mRNA 量が増加している（Fig. 7）。
Drought attenuates plant defence against bacterial pathogens by suppressing the expression of CBP60g/SARD1 during combined stress. Choudhary A, Senthil-Kumar M. Plant Cell Environ. 2022 Feb 1. doi: 10.1111/pce.14275. PMID: 35102557
この論文では乾燥ストレスが CBP60G の発現を抑えることによって病原バクテリアへの応答が抑えられる。発現データベースを見ると糖を多量に与えることなどによっても CBP60G の発現量が低下する。CBP60G の重要性が示されている。
穏やかな高温（28℃）も CBP60G の働きを抑えることが示されている。サリチル酸の作用と生合成にはきわめて多数の因子が関与しているが、28℃に対する応答では CBP60G が決定的な役割を果たしている。
Increasing the resilience of plant immunity to a warming climate Nature. 2022 Jun 29. doi: 10.1038/s41586-022-04902-y. Online ahead of print. Jong Hum Kim など PMID: 35768511
CBP60g 遺伝子を常に活性化した植物では、28℃でも細菌感染に対する応答が強く起きるようになった (Fig.3a)。
RNA-seq データが GSE152072 and GSE197771 で公開されている。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE152072 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE197771
温度を感知する仕組みとして、GDAC (GBPL defence-activated condensates) と呼ばれる、相分離によって生じる凝集体が働いている。
A phase-separated nuclear GBPL circuit controls immunity in plants Nature. 2021 Jun;594(7863):424-429. doi: 10.1038/s41586-021-03572-6. Epub 2021 May 26. Shuai Huang など PMID: 34040255 PMCID: PMC8478157
ポリエチレングリコールの水溶液をオートクレーブすると二層に分離して、室温に戻ると元に戻る。塩濃度やポリマーの種類を変えると室温でも相分離が起きて、水性二相分配法と呼ばれる。オルガネラの単離に使われることがある。それと同じようなことが核の内部で起きて、凝集体には GBPL3 (At5g46070, GBPL1 は At1g03830, GBPL2 は At2g38840)、Mediator (転写補助因子)、RNA PolII が集合している。それが CBP60G の転写を活性化する。 ポリエチレングリコールの水溶液と同様に、GDAC も温度感受性が高く、室温と 28℃で凝集の仕方が変化する。それによって温度が感知される。低温でサリチル酸の蓄積量が増えることが知られているが、それにも関係するのかもしれない。
温度は外部環境によって決まるが、細胞内のエネルギー代謝によっても熱は発生する。強い光を浴び続けている葉は、有効に利用できなかった光エネルギーによって温度が上昇する。発熱植物ではミトコンドリアから熱が発生する。そういった熱が GDAC に影響を与えるのかどうかは、どうなのだろうか。
GDAC は熱以外の要因によっても安定性、形成と崩壊の平衡定数などが変化するかもしれない。さまざまなストレスのセンサーになる可能性がある。ストレスだけでなく、様々な化合物を低い選択性で認識するレセプターになるかもしれない。
CBP60B というよく似た因子も病原菌応答に働いている。 Arabidopsis CALMODULIN-BINDING PROTEIN 60b plays dual roles in plant immunity. Huang W, Wu Z, Tian H, Li X, Zhang Y. Plant Commun. 2021 Jun 17;2(6):100213. doi: 10.1016/j.xplc.2021.100213. PMID: 34778745
The emerging role of biomolecular condensates in plant immunity Plant Cell. 2022 Apr 26;34(5):1568-1572. doi: 10.1093/plcell/koab240. Wei Wang, Yangnan Gu PMID: 34599333 PMCID: PMC9048959
Phenolic acid-induced phase separation and translation inhibition mediate plant interspecific competition Nat Plants. 2023 Aug 28. doi: 10.1038/s41477-023-01499-6. Online ahead of print. Zhouli Xie など PMID: 37640933
サリチル酸を含む、いわゆる植物由来フェノール性化合物が stress granule (SG) marker である RNA-BINDING PROTEIN 47B (RBP47B At3g19130）と結合し、相分離とストレス顆粒の形成を引き起こす。サリチル酸だけでなく 4-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid なども効果がある。翻訳に対する影響が大きい。
Salicylic acid-mediated innate immunity in Arabidopsis is regulated by SIZ1 SUMO E3 ligase. Lee J, Nam J, Park HC, Na G, Miura K, Jin JB, Yoo CY, Baek D, Kim DH, Jeong JC, Kim D, Lee SY, Salt DE, Mengiste T, Gong Q, Ma S, Bohnert HJ, Kwak SS, Bressan RA, Hasegawa PM, Yun DJ. Plant J. 2007 Jan;49(1):79-90. Epub 2006 Dec 6. PMID: 17163880
Fig. 3 にサリチル酸の蓄積量のグラフがある。数十倍に増加している（この論文では野生型の値が小さい）。npr1 変異と siz1 変異の二重変異体ではもっと増加する。イネはサリチル酸の蓄積量が高いことが知られているが、それに近いかもしれない。NPR1 はオートファジーを誘導してサリチル酸の蓄積量を減らす。
SIZ1 controls cell growth and plant development in Arabidopsis through salicylic acid. Miura K, Lee J, Miura T, Hasegawa PM. Plant Cell Physiol. 2010 Jan;51(1):103-13. doi: 10.1093/pcp/pcp171. Epub 2009 Dec 10. PMID: 20007967
Arabidopsis nitrate reductase activity is stimulated by the E3 SUMO ligase AtSIZ1. Park BS, Song JT, Seo HS. Nat Commun. 2011 Jul 19;2:400. doi: 10.1038/ncomms1408. PMID: 21772271
Fig. 8C, D にサリチル酸の蓄積量の測定結果がある。siz1-2 変異体はサリチル酸の蓄積量が多い。野生型は窒素源が KNO3 でも (NH4)2SO4 でも量に変化はない。siz1-2 変異体では (NH4)2SO4 を窒素源にすると野生型と同じ量に低下する。 siz1 変異体では硝酸イオンを還元しにくいので窒素欠乏になりサリチル酸が増えると考えることができる。 Fig. 1 の写真を見ると、siz1 変異体は窒素源が硝酸イオンのみの条件では生育が悪くなっている。
GSE6583 に、siz1-3 変異体のマイクロアレイデータがある。サリチル酸誘導される遺伝子が強く発現している。乾燥ストレスを与えたデータも入っている。この乾燥は 2hr という短時間の処理である。
Ammonium-mediated reduction in salicylic acid content and recovery of plant growth in Arabidopsis siz1 mutants is modulated by NDR1 and NPR1. Kim JY, Song JT, Seo HS. Plant Signal Behav. 2021 Sep 2;16(9):1928819. doi: 10.1080/15592324.2021.1928819. Epub 2021 May 14. PMID: 33989128
The Arabidopsis E3 SUMO ligase SIZ1 regulates plant growth and drought responses Plant Cell. 2007 Sep;19(9):2952-66. doi: 10.1105/tpc.106.049981. Epub 2007 Sep 28. Rafael Catala 1 , Jian Ouyang, Isabel A Abreu, Yuxin Hu, Haksoo Seo, Xiuren Zhang, Nam-Hai Chua PMID: 17905899 PMCID: PMC2048692
野生型では短時間の乾燥（2, 4, 6 h） で、SUMO-Protein Conjugates の量が増加する (Fig. 3)。siz1-3 では増加が野生型の半分以下に抑えられる。
この論文では siz1-3 は乾燥に弱くなっている（Fig. 4）。
SIZ1 deficiency causes reduced stomatal aperture and enhanced drought tolerance via controlling salicylic acid-induced accumulation of reactive oxygen species in Arabidopsis. Miura K, Okamoto H, Okuma E, Shiba H, Kamada H, Hasegawa PM, Murata Y. Plant J. 2013 Jan;73(1):91-104. doi: 10.1111/tpj.12014. Epub 2012 Nov 1. PMID: 22963672
SIZ1 遺伝子は気孔で強く発現している。siz1 変異体は気孔が開きにくい。生育は野生型よりも少し遅い（Fig. 4a）またはとても悪いこともある (Fig. 5a)。
この論文では、気孔が開きにくいことによって siz1-2, siz1-3 は乾燥ストレスに強くなっている (Fig. 4)。上の論文と反対になっている。 このことについては「siz1 は酸化ストレスに弱い。乾燥時に副次的に起きるストレスの影響ではないか」というようなことが書かれている。これらの二つの論文では乾燥ストレスを水やりを止めることで与えている。長時間の乾燥ストレスになっている。その際に強い光を当てたり温度が高めだったりしたらストレスが複合的になり強く効くのかもしれない。
野生型植物が乾燥ストレスを受けた際、PR1 遺伝子の mRNA 量は増えるというデータも掲載されている (Fig. 6a)。このときの乾燥ストレスは、二週間ポットで育成した植物を 10, 14 日間水を与えずに放置することで長時間かけて乾燥させている。短時間の処理ではない。同じ乾燥ストレスでも短時間と長時間では異なることが起きるという例になっている。
siz1 変異体では常に PR1 遺伝子は強く発現している（Fig. 6a）。cpr5, acd6 も常に PR1 遺伝子は強く発現していて乾燥に強いが、生育が悪いので役に立ちそうにない（Fig. 9c）。
どんな物事にもトレードオフはついて回るので、ストレス耐性を高めながら生育に対する影響を抑えるのは難しい。しかし PMID:21772271 を見ると siz1 変異体は条件次第では野生型と同等な成長をしている。ストレス耐性を高めながら生育に悪い影響が出にくい条件をうまく見つけて、その条件を人間が常に保つようにすることが必要なのだろう。
長時間の乾燥ストレス（水やりを止めて何日もそのまま育成）で PR1 などの mRNA 量が増加するという例は、全く異なる研究グループの報告にも見つかる。
Arabidopsis Di19 functions as a transcription factor and modulates PR1, PR2, and PR5 expression in response to drought stress Mol Plant. 2013 Sep; 6(5):1487-502. doi: 10.1093/mp/sst031. Epub 2013 Feb 12. Wen-Xin Liu などPMID: 23404561
この論文の Fig. 7 B, C, D に PR1, PR2, PR5 の mRNA 蓄積量を測定したデータがある。特に PR1 の増加が著しい。増加は水やりを止めて 12d で少し見られ, 14d, 16d と増えていく。かなり乾燥しないと増えてこないらしい。
興味深いことに、サリチル酸生合成変異体 sid2、サリチル酸受容体変異体 npr1 でも程度はかなり下がるが PR1 mRNA の増加は、はっきりと観測されている。
一方、 乾燥ストレスが CBP60G の発現を抑えることによって病原バクテリアへの応答が抑えられるということを示した論文もある。複雑なしくみが存在するらしい。 Drought attenuates plant defence against bacterial pathogens by suppressing the expression of CBP60g/SARD1 during combined stress. Choudhary A, Senthil-Kumar M. Plant Cell Environ. 2022 Feb 1. doi: 10.1111/pce.14275. PMID: 35102557
SnRK1 は細胞のエネルギー状態をシグナルとして様々な機能を調節する重要な因子として注目されている。SIZ1 が変異で失活すると SnRK1 が活性化する。この活性化はサリチル酸が増加したせいではない。また SnRK1 の活性とサリチル酸の量に関連があるという論文は、シロイヌナズナでは一つもない。イネで一つあった。
SUMOylation represses SnRK1 signaling in Arabidopsis Plant J. 2016 Jan;85(1):120-133. doi: 10.1111/tpj.13096. Pierre Crozet など PMID: 26662259 PMCID: PMC4817235
The energy sensor OsSnRK1a confers broad-spectrum disease resistance in rice. Filipe O など Sci Rep. 2018 Mar 1;8(1):3864. doi: 10.1038/s41598-018-22101-6. PMID: 29497084
ユビキチン経路では E3 ligase が E1, E2 と共同して基質となるタンパク質にユビキチンを結合させる。E3 の特別なクラスに E4 という名前がついていて、既に基質に結合したユビキチンの鎖をさらに伸ばす働きを持つ。その一つの UBE4 別名 PUB1, UFD2 の変異体では PR1 などの発現量が増大する。これは NPR1 が安定化することによる。
Dynamic ubiquitination determines transcriptional activity of the plant immune coactivator NPR1. Skelly MJ, Furniss JJ, Grey H, Wong KW, Spoel SH. Elife. 2019 Oct 7;8:e47005. doi: 10.7554/eLife.47005. PMID: 31589140
Nα-acetyltransferase NAA50 mediates plant immunity independent of the Nα-acetyltransferase A complex. Armbruster L など Plant Physiol. 2024 Apr 8:kiae200. doi: 10.1093/plphys/kiae200. PMID: 38588051
NAA50 は Nα-acetyltransferase をコードしている遺伝子である。この遺伝子の機能を適度に抑えると、サリチル酸作用が活性化する。Nα-acetyltransferase はタンパク質の N末端のアミノ基をアセチル化する。遺伝子機能が大きく抑えられると生育が非常に悪くなってしまう。適度に抑えた場合生育に対する悪影響はほとんどない。
UniProt によると NAA50 は Acyl-CoA N-acyltransferases (NAT) superfamily protein, At5g11340, Separation anxiety protein-like と注釈されている。
タンパク質の N末端のアミノ基のアセチル化に関係している遺伝子には他にも hypk-3 (Nascent polypeptide-associated complex subunit alpha-like protein 3, At5g13850), muse6 (= NAA15, At1g80410) などがある。これらが変異すると乾燥耐性が上昇する。しかし NAA50 の機能を抑えても乾燥耐性は変化しなかった。
サリチル酸の量を測定した結果がある。amiNAA50 はサリチル酸が増えていない。hypk-3, muse6 はそれぞれ二倍に増加している。
The cpr5 mutant of Arabidopsis expresses both NPR1-dependent and NPR1-independent resistance Plant Cell. 1997 Sep;9(9):1573-84. doi: 10.1105/tpc.9.9.1573. S A Bowling 1 , J D Clarke, Y Liu, D F Klessig, X Dong PMID: 9338960 PMCID: PMC157034
CPR は Constitutive expression of SAR の略 PR1, BGL2 などの SAR, SA 関連遺伝子が常に発現している。npr1 と二重変異になると発現量が低下するが、1/3 くらいは残っている (Fig. 4)。Fig. 5 にサリチル酸の量を測定したデータがある。WT の 50 倍くらいに増加している。
cpr5 では PDF1.2 遺伝子の発現も大きく増加する (Fig. 2)。これは npr1 と二重変異になっても変化がない。ジャスモン酸が働いているらしい。
GSE5745 に cpr5 に関するアレイデータがある。
Arabidopsis CPR5 is a senescence-regulatory gene with pleiotropic functions as predicted by the evolutionary theory of senescence J Exp Bot. 2007; 58(14):3885-94. doi: 10.1093/jxb/erm237. Epub 2007 Nov 22. Hai-Chun Jing など PMID: 18033818
Fig.2 にサリチル酸とジャスモン酸の量を測定したデータがある。サリチル酸は大きく増加している。ジャスモン酸も倍率は少し低いが増加している。
Fig. 3 にセネッセンスに関する写真、データがある。cpr5 変異体はセネッセンスしやすい。セネッセンスのマーカーである SAG12 遺伝子などの発現量が増加している。PR1 の mRNA 量も増加している。
2022 年になって、CPR5 タンパク質の機能を明らかにした論文が発表された。
CONSTITUTIVE EXPRESSER OF PATHOGENESIS-RELATED GENES 5 is an RNA-binding protein controlling plant immunity via an RNA processing complex Plant Cell. 2022 Apr 26;34(5):1724-1744. doi: 10.1093/plcell/koac037. Shun Peng など PMID: 35137215 PMCID: PMC9048907
CPR5 タンパク質は Nucleoporin 核膜孔で働くタンパク質であり、核内での RNA processing にも働く多機能タンパク質だった。
NPR1 タンパク質と CPR5 タンパク質にどのような関係があるのか、興味深い。
栄養欠乏状態ではオートファジーがおきる。サリチル酸はサリチル酸自体の量を増加させるように作用し、同時にオートファジーを引き起こす。オートファジーはサリチル酸の量・作用を抑制することで過剰なサリチル酸作用が起きないようにする。そのため、オートファジーに関する遺伝子が変異するとサリチル酸の蓄積量が増加する。
Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Yoshimoto K, Jikumaru Y, Kamiya Y, Kusano M, Consonni C, Panstruga R, Ohsumi Y, Shirasu K. Plant Cell. 2009 Sep;21(9):2914-27. doi: 10.1105/tpc.109.068635. Epub 2009 Sep 22. PMID: 19773385
Table 1 に atg5 変異体と野生型のホルモン量の定量結果がある。サリチル酸の蓄積量が約 3 倍に増加している。ロゼット葉の段階で atg5 が示す生育抑制、細菌感染時の過剰な細胞死、早いセネッセンスは、npr1 変異によって打ち消される (Fig. 3)。しかし小さな芽生えの段階では打ち消されない性質もある(Fig. 4)。
Autophagy contributes to regulation of the hypoxia response during submergence in Arabidopsis thaliana. Chen L, Liao B, Qi H, Xie LJ, Huang L, Tan WJ, Zhai N, Yuan LB, Zhou Y, Yu LJ, Chen QF, Shu W, Xiao S. Autophagy. 2015;11(12):2233-46. doi: 10.1080/15548627.2015.1112483. PMID: 26566261 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4835207/
Fig. 7A にサリチル酸の蓄積量のデータがある。atg5-1 変異体では約 2 倍に増加している。
Autophagy Increases Zinc Bioavailability to Avoid Light-Mediated Reactive Oxygen Species Production under Zinc Deficiency Plant Physiol. 2020 Mar;182(3):1284-1296. doi: 10.1104/pp.19.01522. Daiki Shinozaki ら PMID: 31941669 PMCID: PMC7054869
Supplemental Figure S8 にサリチル酸量の測定結果がある。atg5 変異体では約 3 倍に増加している。野生型が亜鉛欠乏になるとサリチル酸が約 2 倍に増加する。atg5 でもさらに増加する。
TRAF Family Proteins Regulate Autophagy Dynamics by Modulating AUTOPHAGY PROTEIN6 Stability in Arabidopsis. Qi H, Xia FN, Xie LJ, Yu LJ, Chen QF, Zhuang XH, Wang Q, Li F, Jiang L, Xie Q, Xiao S. Plant Cell. 2017 Apr;29(4):890-911. doi: 10.1105/tpc.17.00056. Epub 2017 Mar 28. PMID: 28351989 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5435438/
TRAF1a and TRAF1b (encoded by At5g43560 and At1g04300) の変異体は、サリチル酸の蓄積量とジャスモン酸の蓄積量が大きく増えている。これらの因子はオートファゴソームの形成を促進する働きがある。
損傷したミトコンドリアがオートファジーで処理されることを mitophagy という。植物でも研究が進んでいる。
Mitophagy: A Mechanism for Plant Growth and Survival. Broda M, Millar AH, Van Aken O. Trends Plant Sci. 2018 May;23(5):434-450. doi: 10.1016/j.tplants.2018.02.010. Epub 2018 Mar 22. Review. PMID: 29576328
この論文に、ftsh4 変異体とオートファジーの関係が指摘されている。サリチル酸が増加するという性質を示す。
Autophagy Contributes to the Quality Control of Leaf Mitochondria Plant Cell Physiol. 2021 May 11;62(2):229-247. doi: 10.1093/pcp/pcaa162. Sakuya Nakamura など PMID: 33355344 PMCID: PMC8112837
「昆虫に対する自己調節型の宿主植物抵抗性を制御する三要素の可変抵抗器 2023年6月14日 Nature 618, 7966 doi: 10.1038/s41586-023-06197-z 」という論文では、昆虫の唾液に含まれるタンパク質を認識する免疫受容体が、活性化した後にオートファジーで分解されることを示している。それによって活性化したままにはならず、成長を妨げにくくしている。
Time-evolving genetic networks reveal a NAC troika that negatively regulates leaf senescence in Arabidopsis. Kim HJ, Park JH, Kim J, Kim JJ, Hong S, Kim J, Kim JH, Woo HR, Hyeon C, Lim PO, Nam HG, Hwang D. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 May 22;115(21):E4930-E4939. doi: 10.1073/pnas.1721523115. Epub 2018 May 7. PMID: 29735710
この論文の Fig. 3C に、ANAC090 が働かなくなった変異体では PR1 の mRNA 蓄積量が大きく増加するというデータがある。Fig. 4C ではサリチル酸の蓄積量も測定されている。これも ANAC090 で大きく増加する。ANAC090 は ANAC017, ANAC082 と三者で一体 troika となってセネッセンスの制御を行っている。ANAC017 は活性酸素に応じて、またミトコンドリアに異常が生じた際に活性化させることでも知られている。この論文では、活性酸素応答のマーカーである At2g21640 という遺伝子の発現が anac017 変異体で大きく上昇していることが示されている。
The mitochondrial protease FtSH4 regulates leaf senescence via WRKY-dependent salicylic acid signal. Zhang S, Li C, Wang R, Chen Y, Shu S, Huang R, Zhang D, Xiao S, Yao N, Li J, Yang C. Plant Physiol. 2017 Mar 1. pii: pp.00008.2017. doi: 10.1104/pp.16.00008. PMID: 28250067
Table 1, 2 にSA 量を測定した結果がある。遊離型 SA は約二倍、配糖体化したものを合わせた Total SA は5倍に増えている。WRKY75 という転写因子が働かなくなると、SA は増加しなくなる。PR1 遺伝子、sid2 遺伝子などの mRNA 量が増加している。 Fig. 10 にメカニズムを推理した図がある。FTSH4 はミトコンドリア膜に存在する何らかの複合体に作用する。作用（プロテアーゼ）がなくなると活性酸素が大量に発生して、WRKY 転写因子が働いてサリチル酸が多く合成される。
WRKY transcription factors involved in activation of SA biosynthesis genes. van Verk MC, Bol JF, Linthorst HJ. BMC Plant Biol. 2011 May 19;11:89. doi: 10.1186/1471-2229-11-89. PMID: 21595875 という論文では、SA 合成に関わる WRKY 転写因子として、WRKY28 と WRKY46 が重要であることが示されている。
WRKY28 が出てくる論文 KLU suppresses megasporocyte cell fate through SWR1-mediated activation of WRKY28 expression in Arabidopsis. Zhao L, Cai H, Su Z, Wang L, Huang X, Zhang M, Chen P, Dai X, Zhao H, Palanivelu R, Chen X, Qin Y. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Jan 16;115(3):E526-E535. doi: 10.1073/pnas.1716054115. Epub 2017 Dec 29. PMID: 29288215
HISTONE DEACETYLASE 6 suppresses salicylic acid biosynthesis to repress autoimmunity. Wu Z, He L, Jin Y, Chen J, Shi H, Wang Y, Yang W. Plant Physiol. 2021 Aug 30:kiab408. doi: 10.1093/plphys/kiab408. Online ahead of print. PMID: 34618093
サリチル酸を生合成するにはコスト、エネルギーが必要になる。またサリチル酸はミトコンドリア電子伝達複合体を阻害したりするので植物自体の生育を抑える作用がある。そのためサリチル酸の生合成は病原菌が存在しない状態ではできるだけ抑制される必要がある。 ヒストンデアセチラーゼ HISTONE DEACETYLASE 6 (HDA6) が失活した変異体 (shining 5, shi5) はサリチル酸合成が常に活性化している。HDA6 は CALMODULIN BINDING PROTEIN 60g (CBP60g) and SYSTEMIC ACQUIRED RESISTANCE DEFICIENT 1 (SARD1) の発現を制御することでサリチル酸の生合成を抑制している。
Acetate-mediated novel survival strategy against drought in plants. Kim JM, To TK, Matsui A, Tanoi K, Kobayashi NI, Matsuda F, Habu Y, Ogawa D, Sakamoto T, Matsunaga S, Bashir K, Rasheed S, Ando M, Takeda H, Kawaura K, Kusano M, Fukushima A, Endo TA, Kuromori T, Ishida J, Morosawa T, Tanaka M, Torii C, Takebayashi Y, Sakakibara H, Ogihara Y, Saito K, Shinozaki K, Devoto A, Seki M. Nat Plants. 2017 Jun 26;3:17097. doi: 10.1038/nplants.2017.97. PMID: 28650429
The modulation of acetic acid pathway genes in Arabidopsis improves survival under drought stress. Rasheed S, Bashir K, Kim JM, Ando M, Tanaka M, Seki M. Sci Rep. 2018 May 18;8(1):7831. doi: 10.1038/s41598-018-26103-2. PMID: 29777132
hda6 変異体は乾燥に強くなる。HDA6 は酢酸生成経路を構成する PDC1, ALDH2B7 の発現量を抑えているので、変異体ではピルビン酸 -> アセトアルデヒド -> 酢酸 -> アセチル CoA という経路が強く働く。この経路はストレス時にアセチル CoA を生成する代替経路になる。特に葉緑体においてアセチル CoA は脂肪酸の生合成に必須であり多量に必要になる。葉緑体にもピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体がありアセチル CoA の生合成に働いている。UniProt で検索すると出てくる。
| At3g25860 | LTA2 PLE2 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component 4 of pyruvate dehydrogenase complex | chloroplastic |
| At2g34590 | Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta-3 | chloroplastic |
HDA6 is required for jasmonate response, senescence and flowering in Arabidopsis. Wu K, Zhang L, Zhou C, Yu CW, Chaikam V. J Exp Bot. 2008;59(2):225-34. doi: 10.1093/jxb/erm300. Epub 2008 Jan 22. PMID: 18212027
HDA6 はジャスモン酸誘導性遺伝子 PDF1.2, VSP2, JIN1, and ERF1 の発現に働いている。
HDA19 is required for the repression of salicylic acid biosynthesis and salicylic acid-mediated defense responses in Arabidopsis Plant J. 2012 Jul;71(1):135-46. doi: 10.1111/j.1365-313X.2012.04977.x. Epub 2012 Apr 13. Sun-Mee Choi など PMID: 22381007
HDA19 が働かなくなると PR1, 2 の mRNA 量が大きく増加する。この効果はサリチル酸の生合成を抑える、サリチル酸を不活性化する、npr1 を同時に導入すると大きく低下する。遊離型の SA 量は少ないが二倍に増加する。ほとんどの SA は配糖体として存在していて 5 倍くらいに増加する（1 マイクログラム / g FW から 3 〜 5 マイクログラム / g FW に増える）。 「We found that HDA19 directly associates with and deacetylates histones at the PR1 and PR2 promoters.」と書かれている。
アセチル CoA や SAM の量がヒストンの修飾に影響を与える可能性もある。
Arabidopsis CHROMATIN REMODELING 19 acts as a transcriptional repressor and contributes to plant pathogen resistance. Kang H, Liu Y, Fan T, Ma J, Wu D, Heitz T, Shen WH, Zhu Y. Plant Cell. 2021 Dec 25:koab318. doi: 10.1093/plcell/koab318. PMID: 34954802
クロマチンの状態（凝集、ゆるむ）がサリチル酸に関係する遺伝子の発現状態を制御する。CHR19 の AGI number は AT2G02090 https://www.uniprot.org/uniprot/Q9ZUL5 で、AtRAD54-like protein、ETL1 という名前も付いている。
ヒストン以外にも様々な分子がメチル化され機能を調節される。
DNA
ROS1-mediated decrease in DNA methylation and increase in expression of defense genes and stress response genes in Arabidopsis thaliana due to abiotic stresses BMC Plant Biol. 2022 Mar 7;22(1):104. doi: 10.1186/s12870-022-03473-4. Liping Yang など PMID: 35255815 ACD6 の転写がストレスで活性化される際にはプロモーターが demethylation 脱メチル化される。それには Repressor of silencing 1 (ROS1) という因子が働いている。ROS1 は RNA-directed DNA methylation (RdDM) を阻害する。
The role of DNA (de)methylation in immune responsiveness of Arabidopsis Plant J. 2016 Nov;88(3):361-374. doi: 10.1111/tpj.13252. Epub 2016 Sep 7. Ana López Sánchez など PMID: 27341062 PMCID: PMC5132069 この論文にも ROS1 が出てくる。Fig.3 では、ros1 変異体では感染によるジャスモン酸誘導性遺伝子 PDF1.2、VSP2 の誘導が少し弱くなることが示されている。
mRNA はアデニンがメチル化されると翻訳されにくくなる。
Plant J. 2020 Mar;101(6):1269-1286. doi: 10.1111/tpj.14589. Epub 2019 Dec 22. Topologies of N 6 -adenosine methylation (m 6 A) in land plant mitochondria and their putative effects on organellar gene expression Omer Murik など PMID: 31657869 DOI: 10.1111/tpj.14589
Arabidopsis SDG8 Potentiates the Sustainable Transcriptional Induction of the Pathogenesis-Related Genes PR1 and PR2 During Plant Defense Response. Zhang X, Ménard R, Li Y, Coruzzi GM, Heitz T, Shen WH, Berr A. Front Plant Sci. 2020 Mar 11;11:277. doi: 10.3389/fpls.2020.00277. eCollection 2020. PMID: 32218796 この論文では対照になる、 WT の菌に感染していない状態での SA 量が検出限界以下と書かれている。sdg8 では菌に感染していない状態での量が増えているが菌が感染した際の最大量よりもずっと少ない。菌が感染した際の SA 量はかえって少なく、減少しやすい。
AtOZF1 Positively Regulates Defense Against Bacterial Pathogens and NPR1-Independent Salicylic Acid Signaling. Singh N, Swain S, Singh A, Nandi AK. Mol Plant Microbe Interact. 2018 Mar;31(3):323-333. doi: 10.1094/MPMI-08-17-0208-R. Epub 2018 Jan 12. PMID: 29327969
ATOZF1 (AT2G19810) 遺伝子は「CCCH-type zinc finger family protein」と注釈されていた。乾燥や暗黒処理など、様々な刺激によって発現が上昇する。サリチル酸の生合成には関与しないが、サリチル酸の作用を促進する。NPR1-dependent, -independent の両方の作用を促進する。またジャスモン酸の作用も促進する働きがある。 AtOZF1 positively regulates JA signaling and SA-JA cross-talk in Arabidopsis thaliana. Singh N, Nandi AK. J Biosci. 2022;47:8. PMID: 35092410
OXI1 induces immunity by coordinating N-hydroxypipecolic acid, salicylic acid and camalexin synthesis New Phytol. 2022 Nov 1. doi: 10.1111/nph.18592. Online ahead of print. Anamika A Rawat など PMID: 36319610
OXI1 protein kinase is required for plant immunity against Pseudomonas syringae in Arabidopsis J Exp Bot. 2009;60(13):3727-35. doi: 10.1093/jxb/erp219. Epub 2009 Jul 2. Lindsay N Petersen など PMID: 19574254 PMCID: PMC2736892
OXI1 は oxidative burst-mediated signaling に関与しているプロテインキナーゼである。 OXI1 を強く働かせると PR1 の発現量が大きく上昇する。サリチル酸生合成、シグナリングに関わる遺伝子 ICS1(SID2), CBP60g, SARD1 などの発現量も上昇する。サリチル酸の蓄積量も増加する。
OXI1 等のプロテインキナーゼの標的を大規模に探索したすばらしい成果が論文として発表されている。
Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Feb 11;117(6):3270-3280. doi: 10.1073/pnas.1919901117. Epub 2020 Jan 28. Pengcheng Wang など PMID: 31992638 PMCID: PMC7022181
Programmed cell death in plants: a pathogen-triggered response activated coordinately with multiple defense functions Cell. 1994 May 20;77(4):551-63. doi: 10.1016/0092-8674(94)90217-8. J T Greenberg, A Guo, D F Klessig, F M Ausubel PMID: 8187175
acd2 は accerated cell death 2 の略で、この変異体では PR-1 遺伝子 mRNA の蓄積量が増加するなどの防御反応がつねに起きている。Table 3 にサリチル酸の蓄積量のデータがある。4回の別々の試行で、野生型と acd2 を試行ごとに比較している。サリチル酸グルコシドの方が遊離型よりも多い。4回ともつねに acd2 の方が多い。こういう実験はばらつきが大きくなりやすいので平均値にしない方がよいのかもしれない。
ACD2 遺伝子は Red chlorophyll catabolite reductase, chloroplastic At4g37000 をコードしていた。クロロフィルの分解に異常が起きると、分解中間体が蓄積してそれらがサリチル酸の蓄積などを引き起こす。ACD1 遺伝子 LLS1 PAO Pheophorbide a oxygenase family protein with Rieske [2Fe-2S] domain AT3G44880 もクロロフィルの分解に関わる酵素をコードしている。
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.24.481826v1
An inosine triphosphate pyrophosphatase safeguards plant nucleic acids from aberrant purine nucleotides New Phytol. 2022 Dec 4. doi: 10.1111/nph.18656. Henryk Straube など PMID: 36464781
通常のプリン塩基代謝では ITP イノシン3リン酸は生成しないが、ストレスによって脱アミノ化 deamination が起こり ITP が生成することがある。ITP を IMP に脱リン酸化して正常なプリン塩基代謝に戻す酵素が発見された。この酵素をコードする遺伝子 At4g13720 に変異が起きるとサリチル酸の量が増加した。
サリチル酸が増加する理由について、DNA にダメージが起きるとサリチル酸が増えるしくみがあるのではないかと考察している。 最近「Plant TIR domains also possess a nuclease activity, can degrade DNA and RNA, and can function as a 2′,3′-cAMP or 2′,3′-cGMP synthetase」 病原菌応答タンパク質を構成するドメインの一つである TIR ドメインは DNA, RNA を分解してシグナル分子 2' 3'-cAMP/cGMP を合成することが明らかにされている。 https://www.science.org/doi/10.1126/science.abo0001
サリチル酸が DNA にダメージを与えるという論文も引用されている。
Li Z, Kim JH, Kim J, Lyu JI, Zhang Y, Guo H, Nam HG, Woo HR.2020. ATM suppresses leaf senescence triggered by DNA double-strand break through epigenetic control of senescence-associated genes in Arabidopsis. The New Phytologist227 (2): 473–484.
Hadwiger LA, Tanaka K.2017. Non-host resistance: DNA damage is associated with SA signaling for induction of PR genes and contributes to the growth suppression of a pea pathogen on pea endocarp tissue. Frontiers in Plant Science 8: 446
Suppression of tryptophan synthase activates cotton immunity by triggering cell death via promoting SA synthesis Yuhuan Miao, Lian Xu, Xin He, Lin Zhang, Muhammad Shaban, Xianlong Zhang, Longfu Zhu Plant J. 2019 Apr;98(2):329-345. doi: 10.1111/tpj.14222. Epub 2019 Feb 21. PMID: 30604574 トリプトファン生合成の中間体であるインドールを与えると、サリチル酸生合成が促進される。
ceh1, csb3 は葉緑体で働くイソプレノイド生合成経路 MEP pathway の後半の酵素 HDS が変異した変異体である。中間体の MEcPP が増加している。上の方でチアミンが出てくるが、MEP pathway で重要な酵素 DXS はチアミンを補酵素とする。また DXS で生じた DXP という分子はチアミンやビタミン B6 の生合成に使われる。
J Exp Bot. 2016 Mar;67(5):1557-66. The plastidial retrograde signal methyl erythritol cyclopyrophosphate is a regulator of salicylic acid and jasmonic acid crosstalk Mark Lemos など PMID: 26733689 PMCID: PMC4762391 DOI: 10.1093/jxb/erv550
Fig. 3 に SA 量を測定したデータがある。ssi2 は大きく増加している。ceh1 は ssi2 の5分の1くらいだが野生型よりもずっと多い。ssi2 では PR1 の mRNA 量がとても多い。ceh1 ではそれほどでもないが野生型よりもずっと多い。SA が多いだけでなく JA 応答性遺伝子の mRNA 量も多い。 MEcPP が細胞内部でストレス応答を引き起こすホルモン、エリシターのように働いているという想像図がある。 「本来蓄積しない異常な中間体が蓄積することでストレス応答が起きる」という例になっている。
アレイデータとして GSE61675 が公開されている。
The Arabidopsis csb3 mutant reveals a regulatory link between salicylic acid-mediated disease resistance and the methyl-erythritol 4-phosphate pathway. Gil MJ, Coego A, Mauch-Mani B, Jordá L, Vera P. Plant J. 2005 Oct;44(1):155-66. doi: 10.1111/j.1365-313X.2005.02517.x. PMID: 16167903
この論文も HDS の変異体を扱っていてサリチル酸のこともはっきりと書かれている。
Reciprocity between a retrograde signal and a putative metalloprotease reconfigures plastidial metabolic and structural states JIN-ZHENG WANG ら SCIENCE ADVANCES 3 Jun 2022 Vol 8, Issue 22 DOI: 10.1126/sciadv.abo0724
という論文が出版された。ceh1 変異体が出てくる。メチルエリスリトール経路の中間体 MEcPP がシグナル分子として働きサリチル酸を増加させる。ceh1 をサプレスする変異体を見つけて、 a putative plastidial metalloprotease (VIR3 At1g56180) が大切であることを発見した。ceh1 ではサリチル酸が大きく増加しているが、vir3 と二重変異になるとかなり正常に近くなる。VIR3 は亜鉛を補因子として含む。これは NPR1 タンパク質と同じである。VIR3 の基質には thylakoidal isoform of APX (tAPX; At1G77490) and plastidial GAPDH isoform B (GAPB; At1G42970) がある。
Accumulation of endogenous peptides triggers a pathogen stress response in Arabidopsis thaliana. Kmiec B, Branca RMM, Berkowitz O, Li L, Wang Y, Murcha MW, Whelan J, Lehtiö J, Glaser E, Teixeira PF. Plant J. 2018 Nov;96(4):705-715. doi: 10.1111/tpj.14100. PMID: 30242930
PreP1 (ZNMP1, At3g19170), PreP2 (ZNMP2, At1g49630), OOP (TOP1, At5g65620) をすべて欠損したシロイヌナズナでは PR1 などの発現量が増大する。これらのペプチダーゼは葉緑体とミトコンドリアの両方で働くと UniProt には書かれている。
Amino acid homeostasis modulates salicylic acid-associated redox status and defense responses in Arabidopsis. Liu G, Ji Y, Bhuiyan NH, Pilot G, Selvaraj G, Zou J, Wei Y. Plant Cell. 2010 Nov;22(11):3845-63. doi: 10.1105/tpc.110.079392. Epub 2010 Nov 19. PMID: 21097712
PR1 の発現量が上昇している。サリチル酸の量は正常な状態で 2-3 倍に増加していて、菌が感染するとすばやく増加する (Fig. 3)。 アミノ酸の量のデータが Fig. 6 にある。野生型と lht1 変異体であまり変化はない。Gln は非常に多いが、それが少し減少している。菌が感染した際にも Gln は減少する。
マイクロアレイデータ (ATH1) が GSE19109 で公開されている。lht1 変異体では PR1 が一番強く発現誘導されている。SA 作用のマーカーになる遺伝子の多くが発現誘導のレシオで上位に来ている。
Elicitor-induced plant immunity relies on amino acids accumulation to delay the onset of bacterial virulence Plant Physiol. 2023 Jan 30;kiad048. doi: 10.1093/plphys/kiad048. Xiaomu Zhang など PMID: 36715647
エリシターである flg22 を与えると葉に含まれる遊離アミノ酸量、葉の細胞間隙に存在する遊離アミノ酸量が増加する。グルタミン酸が一番顕著に増加する (p-valueで判断)。その次がアラニンである。蓄積したアミノ酸自体が抵抗性を高める。
グルタミン酸が免疫応答を活性化するという論文は以前から発表されている。この論文では Gln + Ser で PR1 が上昇することを示している。
またこの論文の Fig. 4 では、サリチル酸を合成できない sid2 変異体では flg22 による遊離アミノ酸量の増加が見られなくなることを示している。sid2 では抵抗性が高くなりにくい。
しかし sid2 ではアミノ酸の量以外にも大きな変化が生じる。そこでアミノ酸の量だけが変化する変異体を用いた実験を行った。 GLUTAMINE DUMPER-1 gdu1 の活性化型変異体 gdu1-1D では細胞外の GLN 量が増加すると同時に抵抗性が高まる。
L-Glutamate activates salicylic acid signalling to promote stomatal closure and PR1 expression in Arabidopsis. Tsuruda T, Yoshida R. Physiol Plant. 2023 Jan 19:e13858. doi: 10.1111/ppl.13858. Online ahead of print. PMID: 36658465
グルタミン酸は、 glutamate receptor-like 3.5 gene (GLR3.5) を介して PR1 の転写産物の蓄積を誘導する。この作用には NPR1 が必要である。SRK2E/OST1 という SnRK2 に属するプロテインキナーゼも関与している。4 週間目のロゼット葉を葉柄から切り出して処理溶液を吸わせる。1 mM 以上の濃度で与えて、24時間後に測定している。グリシンでも GLR3.5 に作用するので効果がある (Fig. 2A)。サリチル酸の量は2倍以上に増加している（Fig. 3C）。
Glutamine induces lateral root initiation, stress responses, and disease resistance in Arabidopsis. Liao HS, Lee KT, Chung YH, Chen SZ, Hung YJ, Hsieh MH. Plant Physiol. 2024 Mar 11:kiae144. doi: 10.1093/plphys/kiae144. PMID: 38466723
植物の芽生えに含まれる可溶性アミノ酸の量を測定するとグルタミンは半分くらいを占め、最も多い。アンモニウムイオンをアミノ酸に取り込む重要な役割を果たしている。
この論文ではシロイヌナズナの芽生えを、5 mM のグルタミンを窒素源とした培地で育成した。対照として 5 mM の NH4NO3 を含む培地で 12 日間育成した芽生えを用いた。さまざまな遺伝子の発現に大きな違いが見られたが、サリチル酸作用のマーカーである PR1 の発現量が大きく増加していた (Fig. 7B, Fig. 8)。SARD1, PBS3 等も増加していた (Fig. 5A, Fig. 8)。
RNAseq データが GSE206966 and GSE243222 で公開されている。
The Roles of Functional Amino Acids in Plant Growth and Development. Kawade K, Tabeta H, Ferjani A, Hirai MY. Plant Cell Physiol. 2023 Dec 21;64(12):1482-1493. doi: 10.1093/pcp/pcad071. PMID: 37489637 というすばらしい総説が公開されている。 スレオニンの作用について Skotomorphogenesis exploits threonine to promote hypocotyl elongation. Tabeta H, Higashi Y, Okazaki Y, Toyooka K, Wakazaki M, Sato M, Saito K, Hirai MY, Ferjani A. Quant Plant Biol. 2022 Nov 22;3:e26. doi: 10.1017/qpb.2022.19. eCollection 2022. PMID: 37077988 という論文が出版されている。
上に書いたように MEP 経路の異常、プリン塩基代謝の異常、トリプトファン生合成の異常、クロロフィルの分解中間体、ペプチドの分解異常、アミノ酸トランスポーターの欠損というかなりかけ離れた多種類の刺激でサリチル酸が増加する。異常な中間体の量が増加する（分解されるべき分子が分解されない）と、それらを認識するしくみが働きその結果として活性酸素やサリチル酸が増加するような気がする。 この考えは、広島大学の坂本教授のグループによる、アラントインに関する研究成果に inspire されたものである。 「植物のプリン分解 : 最近の進展と見えてきたストレス適応における役割」 植物の生長調節 53:(2) 116-123 (2018年) https://www.jstage.jst.go.jp/article/jscrp/53/2/53_116/_pdf/-char/ja 通常は量が少ない中間代謝物がストレス条件で蓄積することが、ストレスに対する対応をトリガーするという概念が示されている。アラントインの場合ジャスモン酸作用が起きる。
アミノ酸のバランスが崩れることも異常な中間体を増加させるのかもしれない。ペプチドの分解異常がサリチル酸作用を引き起こすことに関しては、植物科学の最前線（BSJ-Review） https://bsj.or.jp/jpn/general/bsj-review/archive.php#BSJ-Review-12A で公開されている、西村健司先生による解説「葉緑体プロテアーゼによるオルガネラ恒常性と細胞内情報伝達の制御」で詳しく解説されている。認識するしくみには自然免疫の受容体のような分子が働いていると推測されている。2023 年 3 月の植物生理学会年会では西村先生による「葉緑体ストレスに応答する植物免疫受容体の解析」という発表があった。
動物細胞の話だが、細胞質ゾルの監視機構がミトコンドリアUPRを活性化する 2023年6月22日 Nature 618, 7966 doi: 10.1038/s41586-023-06142-0 という論文ではミトコンドリアから放出される活性酸素と、細胞質ゾルに蓄積するミトコンドリアタンパク質前駆体（c-mtProt）がミトコンドリア機能の障害を核に伝えるシグナルとして働いていることを示している。「異常な前駆体の量が増加すると、それらを認識するしくみが働きシグナルが伝わる」というしくみになっている。
Impaired PSII Proteostasis Promotes Retrograde Signaling via Salicylic Acid. Duan J, Lee KP, Dogra V, Zhang S, Liu K, Caceres-Moreno C, Lv S, Xing W, Kato Y, Sakamoto W, Liu R, Macho AP, Kim C. Plant Physiol. 2019 Aug;180(4):2182-2197. doi: 10.1104/pp.19.00483. Epub 2019 Jun 3. PMID: 31160506
サリチル酸の増加量は小さい（Fig. 4d）が、一部の（かなり少ない種類の） SA 誘導性遺伝子の発現上昇が見られる (Fig. 4c)。5-days-old というとても小さい芽生えをサンプルにしている（大きくなると斑入りになることによる二次的な変化が出てくるので、斑入りになる前の子葉だけの段階で使っているらしい）。ICS1 の発現量は増加していない（Fig. 6）。これは小さい芽生えだからかもしれない。光合成に伴うストレスが重要なので、var2 でのサリチル酸作用は暗所、弱めの光強度では見られず光を照射することで強くなる。特に PR1 に対して光ストレスの効果が大きい（Fig. 8c）。
https://www.uniprot.org/uniprotkb/P94077/entry LSD1 遺伝子が機能しなくなると活性酸素をトリガーとした PCD が起きやすくなる。その際にサリチル酸が増加する。コードされているタンパク質の機能ははっきりしていない。Zn finger が存在する。Zn は NPR1 にも含まれている。
LSD1 タンパク質が出てくる論文があった。
The m6A reader ECT1 drives mRNA sequestration to dampen salicylic acid-dependent stress responses in Arabidopsis Plant Cell. 2023 Dec 2:koad300. doi: 10.1093/plcell/koad300. Online ahead of print. Keun Pyo Lee など PMID: 38041863
以前の研究で、サリチル酸（SA）誘導性細胞死の負の調節因子であるLSD1と相互作用するYTHファミリータンパク質がいくつか見つかりました (YTH domain-containing protein)。 そこで、これらのタンパク質がSA応答性のm6A readersとして機能し、SA駆動型ストレス応答にどのような影響を与えるかを調べました（Bing AI による翻訳）。
ECT1 は At3g03950 アラビドプシスの13種類のYTHファミリータンパク質の一つです。これはSA駆動型ストレス応答を調節する重要な因子であることを発見しました。ECT1は液-液相分離を起こして細胞質に凝集体を形成し、その中でSA誘導性のm6A修飾を受けやすいmRNA（SA-m6A-mRNA）を隔離して分解を促進します。これにより、SA駆動型ストレス応答を抑制し、植物の発育に悪影響を与えることを防ぎます。ECT1の過剰発現植物は細菌に対して感受性が高くなります（Bing AI による翻訳）。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5884591/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7608151/
NFS1 は Cys desulfurases をコードして FeS Iron sulfur cluster の生合成に働く。ミトコンドリアで働いている。NFS2 は葉緑体で働く。 NFS1 を過剰発現するとサリチル酸応答が起きる。RNA-seq を行っている。
Genome editing of a rice CDP-DAG synthase confers multipathogen resistance Gan Sha など Nature volume 618, pages1017–1023 (2023)
まず rbl1 変異体 RESISTANCE TO BLAST1 を単離した。 「rbl1 showed significant upregulation of ROS, accumulation of salicylic acid」 と書かれている。RBL1 遺伝子は CDP-DAGシンターゼをコードしていた。この遺伝子をゲノム編集で操作することで病害抵抗性を付与し、しかも生育に悪い影響がないようにすることができた。
Voltage-dependent anion channel 3 (VDAC3) mediates P. syringae induced ABA-SA signaling crosstalk in Arabidopsis thaliana. Singh N, Ravi B, Saini LK, Pandey GK. Plant Physiol Biochem. 2023 Dec 12;206:108237. doi: 10.1016/j.plaphy.2023.108237. Online ahead of print. PMID: 38109831
Voltage-dependent anion channel 3 (VDAC3) At5g15090 は 「Mitochondrial outer membrane protein porin 3, Protein HYPERSENSITIVE RESPONSE 2 (HSR2), Athsr2, Voltage-dependent anion-selective channel protein 3」と UniProt に注釈されている。ミトコンドリア外膜で働いている。
「overexpression of VDAC3 resulted in hyperaccumulation of Pathogenesis related gene1 (PR1) transcript.」 と書かれている。 しかし「 overexpression of AtVDAC3 did not show constitutive expression of ICS1 or PR1, 」と書いてあり、感染が起きた際の一過的な変化らしい。 サリチル酸の量は測定されていない。
Deficiencies in cluster-2 ALA lipid flippases result in salicylic acid-dependent growth reductions. Davis JA, Poulsen LR, Kjeldgaard B, Moog MW, Brown E, Palmgren M, López-Marqués RL, Harper JF. Physiol Plant. 2024 Mar-Apr;176(2):e14228. doi: 10.1111/ppl.14228. PMID: 38413387
Mutant noxy8 exposes functional specificities between the chloroplast chaperones CLPC1 and CLPC2 in the response to organelle stress and plant defence. López B, Izquierdo Y, Cascón T, Zamarreño ÁM, García-Mina JM, Pulido P, Castresana C. Plant Cell Environ. 2024 Mar 18. doi: 10.1111/pce.14882. PMID: 38500380
Natural variation among Arabidopsis thaliana accessions for transcriptome response to exogenous salicylic acid Plant Cell. 2007 Jul;19(7):2099-110. doi: 10.1105/tpc.107.050641. Epub 2007 Jul 13. Hans van Leeuwen など PMID: 17630278 PMCID: PMC1955704
この論文の sup.table 3 に、Gene Lists for Each of the 54 Gene Networks SA と関係する遺伝子グループを 54 個構成してリストにしたテーブルがある。いまいち意味がわからない。
この論文の Supplemental figure 1 に、SA が高濃度では生育阻害作用を示すこと、また阻害するために必要な濃度はシロイヌナズナの系統によって異なることを示すデータがある。Van という系統はダメージを受けやすい。Col は受けにくい。実験では 0.3 mM の SA を与えている。
Supplemental table 1 には、代表的なサリチル酸誘導性遺伝子、ジャスモン酸誘導性遺伝子、傷害刺激誘導遺伝子のリストがある。
SA は
| EDS1 | PAD4 | AtWRKY18 | EDS5 (SID1) | PR1 | PLDgamma1 | WAK1 | AtERF1 | PR5 | PAD3 | GST1 | RAR047 | ap4.3a | PR2 (BGL2) | HEL (PR4) | NHL3 |
| At3g48090 | At3g52430 | At4g31800 | At4g39030 | At2g14610 | At4g11850 | At1g21250 | At4g17500 | At1g75040 | At3g26830 | At1g02930 | At2g03760 | At2g32800 | At3g57260 | At3g04720 | At5g06320 |
Magical mystery tour: Salicylic acid signalling Environmental and Experimental Botany Volume 114, June 2015, Pages 117-128
Int J Mol Sci. 2019 Dec 17;20(24):6365. doi: 10.3390/ijms20246365. "Salicylic Acid Mutant Collection" as a Tool to Explore the Role of Salicylic Acid in Regulation of Plant Growth under a Changing Environment Kamila Pluhařová ら PMID: 31861218 PMCID: PMC6941003
「植物の全身獲得抵抗性誘導剤の作用機構に関する研究」安田先生の学会奨励賞受賞解説 https://www.jstage.jst.go.jp/article/jpestics/32/3/32_32.291/_pdf 3ページ目に「イネは内生SA 量が非常に多く，SA 処理では抵抗性を誘導できない」と書かれている。
The diversity of salicylic acid biosynthesis and defense signaling in plants: Knowledge gaps and future opportunities Curr Opin Plant Biol. 2023 Feb 24;72:102349. doi: 10.1016/j.pbi.2023.102349. Chhana Ullah など PMID: 36842224 に数種の植物での SA 量の比較図がある。
シロイヌナズナ 4 weeks ロゼット葉では 65 ng / g FW、イネ 4 weeks seedlings leaves では 5121 ng / g FW になっている。サリチル酸グルコシドも加えるとシロイヌナズナでは 374 ng / g FW で、イネでは 8255 ng / g FW と書かれている。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1065408/ では、T. goesingense という植物はシロイヌナズナの 1000 倍くらいのサリチル酸、サリチル酸配糖体を含むことが示されている。
Induction of resistance to diseases in plant by aerial ultrasound irradiation. Kawakami D, Yoshida T, Kanemaru Y, Huarhua Zaquinaula MH, Mizukami T, Arimoto M, Shibata T, Goto A, Enami Y, Amano H, Teraoka T, Komatsu K, Arie T. J Pestic Sci. 2019 Feb 20;44(1):41-47. doi: 0.1584/jpestics.D18-064. PMID: 30820172 という論文があった。植物に超音波で刺激を与えると、その刺激でサリチル酸などの生合成が増加して病害虫抵抗性を獲得するらしい。こういう発見をきっかけとして社会的意義の高い研究が発展する例は多い。
超音波洗浄をすると水槽の温度が上がる。下の方に書いたように、短時間の高温でサリチル酸が増加することが報告されている。これも温度が上昇しているかもしれない。非接触式の温度計やサーモグラフィーを使えば理屈的には検出できるはずである。超音波による微小な振動で細胞内、細胞間で摩擦が生じる。摩擦で摩擦熱が生じる。これは植物にエネルギーを与えていることになるから、とくに適温以下の温度で育成しているならエネルギー的に有利になる。温度が上がると呼吸も活性化するので活性酸素も多く出るかもしれない。超音波を使うと植物体の一部、必要なところだけを加温することができて生育を阻害せずに抵抗性を高めるのに役立つかもしれない。
GSE133324 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE133324 に、「Gene expression profiling study by RNA-seq for identifying genes associated with sound vibration in plant」というデータがあった。これも免疫反応が活性化している。論文も出ている。 Jung J, Kim SK, Jung SH, Jeong MJ et al. Sound Vibration-Triggered Epigenetic Modulation Induces Plant Root Immunity Against Ralstonia solanacearum. Front Microbiol 2020;11:1978. PMID: 32973716
Infrared Laser-Evoked Gene Operator（IR-LEGO）という赤外レーザーを局所的に細胞に照射して加温する技術がある。この方法は局所的に遺伝子発現を誘導することに使われている。温度が生物に与える、これまで見落とされている効果を見つけることにも使えるかもしれない。 IR-LEGO 技術の紹介とその利用方法 化学と生物 Vol. 53, No. 9, 2015年 page 580- 斎田（谷口）美佐子，亀井保博 両先生の解説 1,480 nm の赤外光を照射すると書かれている。葉を局所的に加温するのなら、赤外 LED でもよいかもしれない。それなら安上がりにできる。
Electrical Stimulation Enhances Plant Defense Response in Grapevine through Salicylic Acid-Dependent Defense Pathway. Mori D, Moriyama A, Kanamaru H, Aoki Y, Masumura Y, Suzuki S. Plants (Basel). 2021 Jun 28;10(7):1316. doi: 10.3390/plants10071316. PMID: 34203523
The chloroplast singlet oxygen-triggered biosynthesis of salicylic acid and jasmonic acid is mediated by EX1 and GUN1 in Arabidopsis. Geng R, Li X, Huang J, Zhou W. Plant Cell Environ. 2024 Apr 10. doi: 10.1111/pce.14910. PMID: 38600785
Accumulation of isochorismate-derived 2,3-dihydroxybenzoic 3-O-beta-D-xyloside in arabidopsis resistance to pathogens and ageing of leaves. Bartsch M, Bednarek P, Vivancos PD, Schneider B, von Roepenack-Lahaye E, Foyer CH, Kombrink E, Scheel D, Parker JE. J Biol Chem. 2010 Aug 13;285(33):25654-65. doi: 10.1074/jbc.M109.092569. Epub 2010 Jun 10. PMID: 20538606
Figure 3 に 3, 5, 8 weeks のロゼット葉に含まれるサリチル酸（配糖体を含む）の蓄積量の測定結果がある。野生型 (Col) では 8 週目には 3 週目の 6 倍に増えている。サリチル酸がさらに水酸化された 2,3-DHBA （配糖体を含む）は 8 週目には SA よりも多くなっている。しかし遊離型のサリチル酸の蓄積量の変化は顕著ではない。
Salicylic acid has a role in regulating gene expression during leaf senescence. Morris K, MacKerness SA, Page T, John CF, Murphy AM, Carr JP, Buchanan-Wollaston V.Plant J. 2000 Sep;23(5):677-85. PMID: 10972893
の Table 1、葉のサリチル酸の蓄積量 単位は ng / g fresh weight
MG 128 ± 44 Mature green S1 206 ± 49 Senescence stage 1 S2 494 ± 116 Senescence stage 2
セネッセンスと DNA の損傷に関係があるという論文があった。
ATM suppresses leaf senescence triggered by DNA double-strand break through epigenetic control of senescence-associated genes in Arabidopsis New Phytol. 2020 Jul;227(2):473-484. doi: 10.1111/nph.16535. Epub 2020 Apr 22. Zhonghai Li など PMID: 32163596 損傷、ダメージで生じた DNA, RNA 断片は TIR domain をもつタンパク質の NADase 活性によって分解してシグナル分子 2'3'-cAMP, 2'3'-cGMP が生成する。 TIR ドメインに関するとてもよい総説があった。 Shared TIR enzymatic functions regulate cell death and immunity across the tree of life Kow Essuman など Science 7 Jul 2022 Vol 377, Issue 6605 DOI: 10.1126/science.abo0001
組織の成熟に伴い抵抗性が高くなることは age-related resistance (ARR) と呼ばれている。
Distinct function of SPL genes in age-related resistance in Arabidopsis. Hu L, Qi P, Peper A, Kong F, Yao Y, Yang L. PLoS Pathog. 2023 Mar 22;19(3):e1011218. doi: 10.1371/journal.ppat.1011218. PMID: 36947557
マイクロRNA miR156 (At2g25095) と 転写因子 SPL が関係している。特にSPL2、SPL10、およびSPL11が ARRを活性化する。SPL10は、PAD4の直接活性化によって部分的にサリチル酸(SA)経路の年齢依存的な増強を媒介する。
Salicylate accumulation inhibits growth at chilling temperature in Arabidopsis. Scott IM, Clarke SM, Wood JE, Mur LA. Plant Physiol. 2004 Jun;135(2):1040-9. Epub 2004 Jun 1. PMID: 15173571 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC514138/
シロイヌナズナ（Col）を低温（5 度）で育成すると、常温で育成したものと比較してサリチル酸の量が大きく増加する。配糖体型（細胞内 SA のほとんどを占める）、そうでない型の両方が増加している。 生育日数を揃えて比較（低温では生育が遅い）、生育段階を揃えて比較（低温では時間がかかる）のどちらでも大きな差がはっきりと出ている。低温処理は短時間では効果がなく、かなり長時間処理する必要がある。低温馴化した状態でサリチル酸の蓄積量が増えるのかもしれない。
SA の作用に重要な因子である NPR1 が低温適応にも働いているという論文が発表されていた。 Nat Plants. 2018 Oct;4(10):811-823. doi: 10.1038/s41477-018-0254-2. Epub 2018 Sep 24. NPR1 mediates a novel regulatory pathway in cold acclimation by interacting with HSFA1 factors Ema Olate ら PMID: 30250280
この作用には SA や TGA 転写因子は関与していない。低温になると細胞質の NPR1 オリゴマーが解離して核に移行する。そこで HsfA1 という転写因子を活性化して低温耐性遺伝子を活性化する。
Mitochondrial Stress Induces Plant Resistance Through Chromatin Changes Front. Plant Sci., 22 September 2021 | https://doi.org/10.3389/fpls.2021.704964 Ana López Sánchez など という論文にも npr1 が出てきて、SA と関係なく働くと示されている。 Transcriptome analysis and identification of a transcriptional regulatory network in the response to H2O2. Hieno A, Naznin HA, Inaba-Hasegawa K, Yokogawa T, Hayami N, Nomoto M, Tada Y, Yokogawa T, Higuchi-Takeuchi M, Hanada K, Matsui M, Ikeda Y, Hojo Y, Hirayama T, Kusunoki K, Koyama H, Mitsuda N, Yamamoto YY. Plant Physiol. 2019 May 7. pii: pp.01426.2018. doi: 10.1104/pp.18.01426. [Epub ahead of print] PMID: 31064811 でも、H2O2 が NPR1 を直接活性化することが示されている。
Low Temperature Enhances Plant Immunity via Salicylic Acid Pathway Genes That Are Repressed by Ethylene. Li Z, Liu H, Ding Z, Yan J, Yu H, Pan R, Hu J, Guan Y, Hua J. Plant Physiol. 2020 Jan;182(1):626-639. doi: 10.1104/pp.19.01130. Epub 2019 Nov 6. PMID: 31694900
Atnoa1 mutant Arabidopsis plants induce compensation mechanisms to reduce the negative effects of the mutation. Majláth I, Szalai G, Papp I, Vanková R, Janda T. J Plant Physiol. 2011 Jul 15;168(11):1184-90. doi: 10.1016/j.jplph.2011.01.021. Epub 2011 Mar 9. PMID: 21392840
植物の一酸化窒素に関わる遺伝子として AtNOS1 という遺伝子が見つけられた。その遺伝子が変異すると一酸化窒素の生成に影響があることは確かめられている。しかし直接生成に寄与しているのではない。AtNOS1 は、改名されてAtNOA1 (NO-associated) と呼ばれている。プラスチドで働いていることが見いだされた。
noa1 では光合成が阻害され葉が黄色くなる。葉緑体に局在することと一致している。生育も悪くなる。スペルミジンが増加している。 同時に SA の量が増加している。NO と SA に関係があることはよく知られている。「NO は SAシグナルの下流で働く因子」と、Discussion に書かれている。しかし川北先生の総説 植物の生体防御機構における一酸化窒素の機能 - 日本生化学会 https://seikagaku.jbsoc.or.jp/10.14952/SEIKAGAKU.2016.880192/index.html には、NO が NPR1 タンパク質を S-ニトロソ化して細胞質に止める（SA 作用が起きない）と書かれている。NO と SA は複雑な関係がある。
この論文では植物を低温（４度）で処理しているが、植物の低温適応と SA に関係があることが知られている。低温処理によって、野生型では結合型の SA が増加している。noa1 では常温でも二倍以上多く、低温処理でさらに少し増加する (Fig. 5)。noa1 で SA が増える理由は不明で、光合成などが阻害されることによる様々なストレスが原因かもしれないと書かれている。
https://www.uniprot.org/uniprot/Q66GP9 noa1 は一酸化窒素と関係ない他の性質によっても見いだされ、別の名前も付けられている。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26435530/ RESISTANT TO INHIBITION BY FOSMIDOMYCIN 1 (RIF1) SUPPRESSOR OF VARIEGATION (SVR10) 葉緑体の転写後調節が変化するらしい。
低温と NOA1 の関係を示した論文が発表されている。 OsNOA1 functions in a threshold-dependent manner to regulate chloroplast proteins in rice at lower temperatures. He H, Yang Q, Shen B, Zhang S, Peng X. BMC Plant Biol. 2018 Mar 16;18(1):44. doi: 10.1186/s12870-018-1258-9. PMID: 29548275 低温では NOA1 の必要性が高くなり、欠損すると葉緑体でのタンパク質合成がうまくいかなくなる。そのため葉緑体全体の機能が下がる。そういう状態では SA が増えやすいのかもしれない。
INDUCER OF CBF EXPRESSION 1 promotes cold-enhanced immunity by directly activating salicylic acid signaling. Li S, He L, Yang Y, Zhang Y, Han X, Hu Y, Jiang Y. Plant Cell. 2024 Mar 27:koae096. doi: 10.1093/plcell/koae096. PMID: 38536743
「病害応答に働くサリチル酸の生合成およびシグナル伝達の制御機構に関する研究」 草島先生による、植物化学調節学会奨励賞受賞解説 植物の生長調節 Vol56 No.1 1-6, 2021
施設園芸でのキュウリ栽培技術における発見（温室を閉鎖することで高温処理すると病害抵抗性が高くなる）を基盤、きっかけとして、高温処理が病害抵抗性を誘導することが見いだされた。シロイヌナズナでは 45 ℃ で 2〜3 分、地上部を処理すると PR-1 遺伝子の発現が強く誘導されサリチル酸が増加する。根は高温に弱いので地上部だけを処理するように工夫している。高温ではサリチル酸経路だけでなく ABA 経路も活性化されていると書かれている。SA と ABA は複雑に相互作用していることが示されている。
作物や果樹をお湯で処理することで病害抵抗性が高まるという例は他にも見たことがある。菌に対する効果もあるし、植物の方にも効果がある。
Light prevents pathogen-induced aqueous microenvironments via potentiation of salicylic acid signaling Nat Commun. 2023 Feb 9;14(1):713. doi: 10.1038/s41467-023-36382-7. Gaële Lajeunesse など PMID: 36759607 PMCID: PMC9911384
Pst DC3000 菌を葉にシリンジで接種する。普通に明・暗を繰り返す光条件では感染が起きる。その際に組織が水に浸かったような状態 water-soaking になる。24時間光を当て続けると感染が起きにくい。その際に ICS1, PR1 の発現量が大きく増加する。サリチル酸の量は、何も感染していない場合、暗いままでは少ないが、明暗を繰り返す状態、ずっと光を当てる状態で増加している 。エリシターである flg22 を与えると暗いままの状態でも増加する。エリシターを与えずっと光を当て続ける状態で一番多くなる (Fig. 3C)。
BAH1/NLA, a RING-type ubiquitin E3 ligase, regulates the accumulation of salicylic acid and immune responses to Pseudomonas syringae DC3000. Yaeno T, Iba K. Plant Physiol. 2008 Oct;148(2):1032-41. doi: 10.1104/pp.108.124529. Epub 2008 Aug 27. PMID: 18753285
この論文に「Nitrogen Limitation Induces the Accumulation of SA」と書かれている。窒素源としては硝酸イオンの量を変化させている。bah1-D という変異体は benzoic acid hypersensitive1-Dominant の略で、安息香酸 Benzoic acid (BA) に対する感受性が高い。
野生型は BA を与えてもサリチル酸の蓄積量は増大しない。一方 bah1-D は、BA を与えると約 2 倍に増加する。
この変異体をピートモスだけ（窒素源が少ない）の培地で育成するとサリチル酸の量が増加する。このとき安息香酸 Benzoic acid (BA) の量も増加する。硝酸イオンを与えると減少する。
BAH1 は NLA と言う名前でも知られている。窒素栄養の観点からも研究が進んでいる。「低窒素状態では安息香酸がサリチル酸になりやすい」という可能性も考えられる。
A mutation in NLA, which encodes a RING-type ubiquitin ligase, disrupts the adaptability of Arabidopsis to nitrogen limitation Plant J. 2007 Apr;50(2):320-37. doi: 10.1111/j.1365-313X.2007.03050.x. Epub 2007 Mar 12. Mingsheng Peng 1 , Carol Hannam, Honglan Gu, Yong-Mei Bi, Steven J Rothstein PMID: 17355433
nla 変異体は窒素不足を野生型よりも早い時期に関知してセネッセンスがおきる。窒素が十分なら野生型と変化がない。窒素の取り込みには変化がなかった。正常な窒素不足応答では葉に含まれる窒素が転流して減少する。またアントシアニンが増加する。nla ではそれらの応答が起きなくなる。NLA 遺伝子は At1g02860、RING-type ubiquitin E3 ligase をコードしていた。この論文ではサリチル酸は調べていなかった。
その後出た論文で、サリチル酸の蓄積量についても調べられた。
Loss-of-function of NITROGEN LIMITATION ADAPTATION confers disease resistance in Arabidopsis by modulating hormone signaling and camalexin content Plant Sci. 2022 Jul 12;111374. doi: 10.1016/j.plantsci.2022.111374. Beatriz Val-Torregrosa など PMID: 35839945
Fig. 6 を見ると、PR1 遺伝子の発現量が増加している（菌感染の際よりは弱い）。興味深いことに、ジャスモン酸誘導性遺伝子の PDF1.2 も大きく発現量が増加する。しかし別の重要なジャスモン酸誘導性遺伝子として知られている MYC2 は増加していない。
サリチル酸の蓄積量は3倍くらい、ジャスモン酸の蓄積量も3倍くらいに増加している。
NITROGEN LIMITATION ADAPTATION recruits PHOSPHATE2 to target the phosphate transporter PT2 for degradation during the regulation of Arabidopsis phosphate homeostasis. Park BS, Seo JS, Chua NH. Plant Cell. 2014 Jan;26(1):454-64. doi: 10.1105/tpc.113.120311. Epub 2014 Jan 28. PMID: 24474629
イソコリスミ酸からサリチル酸が生成する経路も窒素欠乏に応答する。
PBS3 = At5g13320 はホルモンにアミノ酸を結合する GH3 タンパク質の一員でイソコリスミ酸からサリチル酸の生成を触媒する。病原菌感染や窒素欠乏で mRNA の蓄積量が大きく増大する。
低窒素条件でサリチル酸の量が増加することは他の論文でも報告されている。
Alternative Polyadenylation and Salicylic Acid Modulate Root Responses to Low Nitrogen Availability. Conesa CM など Plants (Basel). 2020 Feb 16;9(2):251. doi: 10.3390/plants9020251. PMID: 32079121
Fig. 5 A, B に植物ホルモン量を測定した結果がある。 Root, shoot どちらでもサリチル酸の量が大きく増加する。対照的にジャスモン酸の量は減少している。
A guanosine tetraphosphate (ppGpp) mediated brake on photosynthesis is required for acclimation to nitrogen limitation in Arabidopsis Elife. 2022 Feb 14;11:e75041. doi: 10.7554/eLife.75041. Shanna Romand ら PMID: 35156611 PMCID: PMC8887892 Fig. 1 のデータでは hydroxy-octadecatrienoic acids (HOTEs) が増加している。ppGpp は一時的に増加して減少する。GTP の量は経時的に大きく減少している。Fig.5 では葉緑体ゲノムコード遺伝子 (AtCg) 全体の mRNA 量が減少している図がある。
Putrescine elicits ROS-dependent activation of the salicylic acid pathway in Arabidopsis thaliana. Liu C, Atanasov KE, Arafaty N, Murillo E, Tiburcio AF, Zeier J, Alcázar R. Plant Cell Environ. 2020 Nov;43(11):2755-2768. doi: 10.1111/pce.13874. Epub 2020 Sep 14. PMID: 32839979
植物ではアルギニン、オルニチンからポリアミンが作られる。ポリアミンは多様な働きをもつが、病原菌感染に対する働きもある。
プトレシンを葉に与えて24時間後にサリチル酸の量が約5倍に増加している (Fig. 4)。これは与えた葉に置いてのみ見られ、別の葉に刺激が伝わることはない。抵抗性に関与する FMO1, ALD1 遺伝子の発現量も増加する (Fig. S7)。これは別の葉にも伝達されている。
Overexpression of SAMDC1 gene in Arabidopsis thaliana increases expression of defense-related genes as well as resistance to Pseudomonas syringae and Hyaloperonospora arabidopsidis Front Plant Sci. 2014 Mar 27:5:115. doi: 10.3389/fpls.2014.00115. eCollection 2014. Francisco Marco 1, Enrique Busó 2, Pedro Carrasco PMID: 24734036 PMCID: PMC3973925
Overexpressing the SAMDC1 SAM脱炭酸酵素を高発現する植物を作成した。PR1 などの発現量が増大していた。興味深いことに LOX2 などのジャスモン酸誘導性遺伝子も発現量が増大していた（Fig. 1）。
The importance of the urea cycle and its relationships to polyamine metabolism during ammonium stress in Medicago truncatula. Urra M, など J Exp Bot. 2022 Sep 12;73(16):5581-5595. doi: 10.1093/jxb/erac235. PMID: 35608836
窒素源として NO3-, NH4+ を用い、濃度を 1mM, 25mM に変えている。アンモニア 25mM では、Gln, Arg, Orn の量が増加した (Fig. 2)。ポリアミンではプトレシンは Arg と同様な変化を示した。スペルミジンは少しだけ 25mM アンモニアで増加した。スペルミンは窒素源の変化に応答せず一定の量だった (Fig. 3)。アルギニンからのポリアミン合成に関与する ADC の活性はプトレシンの量と全く比例していなかった (Fig. 4)が、オルニチンからのポリアミン合成に関与する ODC の活性は根において比例していた (Fig. 4)。一方、ポリアミン分解酵素である CuAO, PAO の活性はアンモニア 25mM 培地で大きく低下していた (Fig. 5)。 CuAO の活性はアンモニウムイオンで阻害されることも示された (Fig. 6)。
Sulfur Deprivation Modulates Salicylic Acid Responses via Nonexpressor of Pathogenesis-Related Gene 1 in Arabidopsis thaliana Plants (Basel). 2021 May 26;10(6):1065. Steven Criollo-Arteaga など PMID: 34073325 DOI: 10.3390/plants10061065
PR1 遺伝子の発現量を増大させる栄養条件を検索することで、 窒素だけでなくイオウ欠乏でもサリチル酸シグナルが活性化することを見いだした。
栄養が欠乏するとホルモンの生合成も正常に進みにくくなる。それによって他の種類の植物ホルモンが減少するとサリチル酸が増加しやすくなるという関係があるような気がする。またアミノ酸などの重要な代謝産物の生合成もうまく進まず、生合成中間体が蓄積しやすくなる。そういった本来蓄積しないはずの分子が蓄積することがサリチル酸の量を増やす刺激になるということも考えられる。この考えは、広島大学の坂本教授のグループによる、アラントインに関する研究成果に inspire されたものである。 「植物のプリン分解 : 最近の進展と見えてきたストレス適応における役割」 植物の生長調節 53:(2) 116-123 (2018年) https://www.jstage.jst.go.jp/article/jscrp/53/2/53_116/_pdf/-char/ja 通常は量が少ない中間代謝物がストレス条件で蓄積することが、ストレスに対する対応をトリガーするという概念が示されている。アラントインの場合ジャスモン酸作用が起きる。
イオウ欠乏とサリチル酸の関係を示す論文が 2024 年にも発表された。
Multi-omics analyses of sid2 mutant reflect the need of isochorismate synthase ICS1 to cope with sulfur limitation in Arabidopsis thaliana. Luo J, Havé M, Soulay F, Balliau T, Clément G, Tellier F, Zivy M, Avice JC, Masclaux-Daubresse C. Plant J. 2024 Mar 18. doi: 10.1111/tpj.16702. PMID: 38498624
イオウ欠乏培地に移して24時間で ABA の量が減少するという論文が発表されている。 Sulfate availability affects ABA levels and germination response to ABA and salt stress in Arabidopsis thaliana. Plant J. 77: 604–615. PMID: 24330104 イオウ、システイン濃度がストレスで変化する（例えば乾燥ストレスを受けると、細胞内に含まれる分子の濃度は、それらの分子を細胞外や液胞に排出しなければ上昇する）なら、それがストレス感知機構になりうるというようなことを書いた論文があった。しかしそういう仕組みが細胞内で確かに働いていることを示すのは難しい。そういうことができるように考えないといけない。
ABA の量は低酸素状態によっても減少する。 Front. Plant Sci., 24 June 2021 | https://doi.org/10.3389/fpls.2021.661228 ABA Biosynthesis and Signaling Cascades Under Hypoxia Stress Qichao Wang ら
窒素とイオウが組み合わさって生じる代表的な分子にグルタチオン GSH がある。GSH が減るとサリチル酸合成系が活性化する仕組みがあるのかと思ったがそうではなく GSH 生合成変異体 (rml1)、阻害剤 (BSO) で PR-1 の発現は増加しないらしい。 Low glutathione regulates gene expression and the redox potentials of the nucleus and cytosol in Arabidopsis thaliana. Schnaubelt D, Queval G, Dong Y, Diaz-Vivancos P, Makgopa ME, Howell G, De Simone A, Bai J, Hannah MA, Foyer CH. Plant Cell Environ. 2015 Feb;38(2):266-79. doi: 10.1111/pce.12252. Epub 2014 Jan 13. PMID: 24329757 GSH の絶対量だけでなく GSSG/GSH ratio も重要だろうと議論されている。
pad2-1 (phytoalexin deficient 2-1) という変異体は GSH1 遺伝子の機能が低下してグルタチオン量が減少している。いくつかの論文に出てくる。
Plant Signal Behav. 2012 Feb;7(2):210-2. doi: 10.4161/psb.18831. Epub 2012 Feb 1. Role of glutathione in plant signaling under biotic stress Carole Dubreuil-Mauriziなど PMID: 22353869 PMCID: PMC3405692 pad2-1 変異体では活性酸素ストレスに強く応答する遺伝子が発現誘導される。サリチル酸応答性遺伝子はかえって反応しなくなる。
Front Plant Sci. 2017 Aug 28;8:1464. doi: 10.3389/fpls.2017.01464. eCollection 2017. Effects of Combined Low Glutathione with Mild Oxidative and Low Phosphorus Stress on the Metabolism of Arabidopsis thaliana Atsushi Fukushima など PMID: 28894456 PMCID: PMC5581396 グルタチオン量と軽い酸化ストレス（methyl viologen）とリン欠乏という異なる種類のストレスの相互作用を調べている。アントシアニン、グルコシノレートなどの二次代謝産物にも大きな変化がある。 GSE57286 というアレイデータが公開されている。pad2 では PR-1 の発現量は全く高まっていない。
Glutathione degradation activity of γ-glutamyl peptidase 1 manifests its dual roles in primary and secondary sulfur metabolism in Arabidopsis Plant J. 2022 Aug 1. doi: 10.1111/tpj.15912. Online ahead of print. Takehiro Ito など PMID: 35932489 では、グルタチオンの分解、代謝における GGCT2;1 (AT5G26220), GGCT2;2 (AT4G31290), and GGCT2;3 (AT1G44790) という γ-glutamyl cyclotransferases をコードする遺伝子の重要性が示されている。この酵素はグルタチオンを 5-oxo Proline と Cys-Gly に分解する。イオウが十分ある場合グルタチオンの分解は GGP1 γ-glutamyl peptidase 1 AT4G30530 が主に働くが、イオウ欠乏の際にこの経路が活性化する。
Callose Synthesis Suppresses Cell Death Induced by Low-Calcium Conditions in Leaves. Shikanai Y, Yoshida R, Hirano T, Enomoto Y, Li B, Asada M, Yamagami M, Yamaguchi K, Shigenobu S, Tabata R, Sawa S, Okada H, Ohya Y, Kamiya T, Fujiwara T. Plant Physiol. 2020 Apr;182(4):2199-2212. doi: 10.1104/pp.19.00784. Epub 2020 Feb 5.PMID: 32024698
カルシウム欠乏に弱くなる変異体 low-calcium sensitive3 に関して調べている。原因遺伝子は GLUCAN SYNTHASE-LIKE10 カロース合成酵素の一つ At3g07160 をコードしていた。
カルシウム欠乏になると様々な変化が起きるが、サリチル酸応答性遺伝子 PR1、PR2 の発現量が大きく上昇する（Fig. 4）。カルシウムは細胞壁多糖類であるペクチンと結合することがよく知られている。Fig. 5 ではカルシウム欠乏による細胞壁のダメージが何らかのしくみを介してサリチル酸、ジャスモン酸を活性化すると想定されている。
Inhibition of NPR1 activity Leads to Shoot Growth Improvement under Low-Calcium Conditions in Arabidopsis. Hashimoto S, Shikanai Y, Kusajima M, Nakamura H, Toru F, Kamiya T. Plant Cell Physiol. 2023 Aug 31:pcad096. doi: 10.1093/pcp/pcad096. Online ahead of print. PMID: 37650642
カルシウム欠乏状態ではサリチル酸応答性遺伝子の発現が増大し、サリチル酸の量も増加する。PAD4, EDS1, NPR1 が働かなくなるようにするとカルシウム欠乏による生育阻害が緩和される。しかしサリチル酸生合成酵素の変異 sid2-1 では生育を良くする作用はない。NPR1 の活性化を抑える薬剤として tenoxicam を用いた実験も行った。tenoxicam の作用は Oxicam-type non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit NPR1-mediated salicylic acid pathway. Ishihama N, Choi SW, Noutoshi Y, Saska I, Asai S, Takizawa K, He SY, Osada H, Shirasu K. Nat Commun. 2021 Dec 15;12(1):7303. doi: 10.1038/s41467-021-27489-w. PMID: 34911942 で発見された。tenoxicam を与えてもカルシウム欠乏による生育阻害が緩和される。
Involvement of endogenous salicylic acid in iron-deficiency responses in Arabidopsis. Shen C, Yang Y, Liu K, Zhang L, Guo H, Sun T, Wang H. J Exp Bot. 2016 Jul;67(14):4179-93. doi: 10.1093/jxb/erw196. Epub 2016 May 21. PMID: 27208542
サリチル酸が減る変異体 pad4 は、鉄欠乏でも芽生えの葉が緑色を保ちやすい。特に「Soluble な鉄の量」が多くなる。Fig.5 に鉄欠乏によるサリチル酸の量の変化を調べたデータがある。芽生えはサリチル酸の量が元々多く、鉄欠乏でさらに増加する。 サリチル酸は葉緑体で作られる。発達した葉では葉緑体が細胞内の鉄のかなりの部分を保持しているだろう。鉄欠乏で葉緑体の状態がサリチル酸を作りやすいように変化する？
サリチル酸を水酸化して不活性化する酵素は 2-oxoglutarate-Fe(II) oxygenase と呼ばれる水酸化酵素の一つである。このことからすれば鉄が不足した際にサリチル酸が増えやすいのは理にかなっている。一方ジベレリン、アブシジン酸などでは同じタイプの酵素が生合成に働いている。
https://www.omicsdi.org/dataset/geo/GSE74515 では、「Salicylic acid accumulation is required for Fe-deficiency responses in Arabidopsis」というタイトルの RNAseq データが紹介されている。よく似た種類の RNAseq データをリストアップして見つけやすくしている。
Phosphate-induced resistance to pathogen infection in Arabidopsis. Val-Torregrosa B, Bundó M, Martín-Cardoso H, Bach-Pages M, Chiou TJ, Victor F, San Segundo B. Plant J. 2022 Jan 21. doi: 10.1111/tpj.15680. Online ahead of print. PMID: 35061924
細胞内で栄養素は様々な相互作用を行っている。リンは鉄やカルシウムなどと結合して難溶性の形態になることがある。リンが過剰に蓄積する pho2 変異やリンを過剰に与えることでサリチル酸などの量が増加することが見いだされた。同時に活性酸素 ROS の生産、病原菌抵抗性も増加する。
サリチル酸とジャスモン酸は排他的に働く、どちらかが増加するともう一方は減少することが多いが、リン過剰の場合、サリチル酸とジャスモン酸の両方が同時に増加している。またマーカー遺伝子である PR1, PDF1.2, VSP などの発現量も同時に増加している。
Metabolomics analysis reveals potential mechanisms of tolerance to excess molybdenum in soybean seedlings Ecotoxicol Environ Saf. 2018 Nov 30;164:589-596. doi: 10.1016/j.ecoenv.2018.08.062. Epub 2018 Aug 24. Shoujun Xu など PMID: 30149358
Interplay between secondary metabolites and plant hormones in silver nitrate-elicited Arabidopsis thaliana plants. Cañizares E など Plant Physiol Biochem. 2024 Mar 1;208:108483. doi: 10.1016/j.plaphy.2024.108483. PMID: 38457948
Insight into mechanisms of multiple stresses tolerance in a halophyte Aster tripolium subjected to salinity and heavy metal stress. Wiszniewska A, Koźmińska A, Hanus-Fajerska E, Dziurka M, Dziurka K. Ecotoxicol Environ Saf. 2019 May 3;180:12-22. doi: 10.1016/j.ecoenv.2019.04.059. PMID: 31059903
Aster tripolium という、塩ストレスに強い植物を実験材料にしている。Table 2 に、ストレスを受けた際のホルモン量の変化を調べたデータがある。
塩ストレス (300 mM) ではサリチル酸の量は変化しない。Benzoic acid の量が減っている。可溶性の糖の蓄積量が増加している (Fig. 3)。ペクチンの構成成分であるウロン酸が大きく増加している。細胞壁のペクチンはカルシウムと結合した状態にあるが、ナトリウムイオンでカルシウムが溶出してしまう。このことが塩ストレスの一つの要因になる。
サリチル酸の量は 100 microM の CdCl2, PbCl2 で 3〜5 倍に増加する。鉄欠乏で増加するのと関係があるかもしれない。サリチル酸を水酸化する酵素は鉄を補酵素として用いる。
Constitutively elevated salicylic acid signals glutathione-mediated nickel tolerance in Thlaspi nickel hyperaccumulators. Freeman JL, Garcia D, Kim D, Hopf A, Salt DE. Plant Physiol. 2005 Mar;137(3):1082-91. Epub 2005 Feb 25. PMID: 15734913 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1065408/
この論文では重金属に耐性を示す T. goesingense という植物を分析している。この植物はサリチル酸の蓄積量がシロイヌナズナの 1000 倍くらい高く、普通の条件では葉が早く老化してしまう。しかしニッケルを含む土壌で育成すると耐えて生きることができる (Fig. 1 の写真)。
npr1 変異体は野生型と異なる応答をニッケルに対して示した。Fig. 5 にニッケル処理をしたときのサリチル酸の蓄積量のグラフがある。野生型のシロイヌナズナは、ニッケル処理 50 ~ 100 μM でサリチル酸の蓄積量はほとんど変化しない。 しかし npr1 変異体では大きく増加している。 Fig. 6 では、npr1 変異体は 100 μMのニッケルに耐性を示している。T. goesingense よりも耐性は弱いが野生型よりもはっきりと強い。 サリチル酸が存在すると、ニッケルストレスによる脂質の過酸化がおきにくくなり耐性が高くなる。
ATP は「細胞のエネルギー通貨」として様々な化学反応、細胞内の運動のエネルギー源として働くことは生物学の教科書に必ず記載されている。また ATP はエネルギー源として働くだけでなく、細胞に対する調節因子、シグナルとしても働く。
Extracellular ATP is a regulator of pathogen defence in plants. Chivasa S, Murphy AM, Hamilton JM, Lindsey K, Carr JP, Slabas AR. Plant J. 2009 Nov;60(3):436-48. doi: 10.1111/j.1365-313X.2009.03968.x. Epub 2009 Jul 6. PMID: 19594709
AMP-PCP という ATP のアナログを葉に与えると PR-1 などの mRNA 量が増加する。ヘキソキナーゼを与えて ATP を消費させても PR-1 の mRNA 量が増加する。
サリチル酸を与えると細胞外 ATP (eATP) の量が減少する。サリチル酸で PR-1 が誘導されている状態で ATP を与えると、PR-1 の mRNA 量が減少する。
Fig.8 にサリチル酸の蓄積量を測定したデータがある。ATP を与えると少し減少する。
Cyclic nucleotide‐gated ion channel 6 is involved in extracellular ATP signaling and plant immunity Plant J. Pages: 1386-1396 | First Published:16 December 2021 Ha N. Duong など
細胞外 ATP がミトコンドリアのカルシウムイオン濃度を上昇させるというデータが示されている論文があった。それには MCU1, MCU2, MCU3 というイオンチャネルが関わっている。細胞質のカルシウム濃度の調節にはそれらと別のしくみが働いている。 mcu1 2 3 の三重変異体はほとんど成長に変化はない。しかし「mcu1 2 3 seedlings show deregulated jasmonic acid homeostasis and impaired touch signaling」 ジャスモン酸、接触刺激応答に変化があった。
MCU proteins dominate in vivo mitochondrial Ca2+ uptake in Arabidopsis roots Plant Cell. 2022 Oct 27;34(11):4428-4452. doi: 10.1093/plcell/koac242. Cristina Ruberti など PMID: 35938694 PMCID: PMC9614509
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5681908/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18650403/
''Global analysis of Arabidopsis gene expression uncovers a complex array of changes impacting pathogen response and cell cycle during geminivirus infection '' Plant Physiol. 2008 Sep;148(1):436-54.doi: 10.1104/pp.108.121038. Epub 2008 Jul 23. José Trinidad Ascencio-Ibáñez など PMID: 18650403 PMCID: PMC2528102
PR-1 などの発現量が高まっている。Geminivirus は様々な遺伝子をコードしている。それらの遺伝子にコードされているタンパク質のいくつかは、宿主が持つ重要な酵素、因子と結合してそれらの活性を変えてしまう。それによって様々な変化が生じる。
アグロバクテリウムが保持する Ti プラスミド、Ri プラスミドには様々な興味深い遺伝子がコードされている。サリチル酸シグナルを活性化する機能を持つ遺伝子があることが発見された。
Overexpression of the A4-rolB gene from the pRiA4 of Rhizobium rhizogenes modulates hormones homeostasis and leads to an increase of flavonoid accumulation and drought tolerance in Arabidopsis thaliana transgenic plants. Veremeichik GN, など Planta. 2022 Jun 11;256(1):8. doi: 10.1007/s00425-022-03927-x. PMID: 35690636
A4-rolB gene はカルシウムイオンや活性酸素生成に影響を与えてサリチル酸などの量を増やすと書かれている。
The potyviral protein 6K2 from turnip mosaic virus increases plant resilience to drought. Prakash V, Nihranz CT, Casteel C. Mol Plant Microbe Interact. 2022 Dec 19. doi: 10.1094/MPMI-09-22-0183-R. Online ahead of print. PMID: 36534062
Turnip mosaic virus にコードされている 6K2 遺伝子を恒常的に発現させると乾燥に強くなった。その際に ABA は増加しておらず、SA が増加していた。しかしその増加の度合いは2倍以下で小さい。この増加は乾燥処理をした際に見られ、十分水を与えた場合は SA 量は増加しなかった。ABA と関係ないしくみで乾燥耐性が高まっていた。生育に対する悪影響はほとんどなかった。PR1 などの発現量のデータはない。
HC-Pro viral suppressor from tobacco vein banding mosaic virus interferes with DNA methylation and activates the salicylic acid pathway. Yang L, Xu Y, Liu Y, Meng D, Jin T, Zhou X. Virology. 2016 Oct;497:244-250. doi: 10.1016/j.virol.2016.07.024. Epub 2016 Aug 4. PMID: 27497186
Tobacco vein banding mosaic virus (TVBMV) がコードする heper-component protease (HC-Pro) は、 SA の制御因子である ACD6 and NPR1 のプロモーター DNA のメチル化を阻害する。それによって SA シグナルが活性化する。これはプロモーターから生成する siRNA を HC-Pro が分解することによるらしい。
The role of DNA (de)methylation in immune responsiveness of Arabidopsis Plant J. 2016 Nov;88(3):361-374. doi: 10.1111/tpj.13252. Epub 2016 Sep 7. Ana López Sánchez など PMID: 27341062 PMCID: PMC5132069
オゾンは３個の酸素原子からなる分子で反応性が高い。活性酸素と近い働きをする。大気汚染で高濃度のオゾンが大気中に蓄積すると植物にダメージを与える。植物のオゾンに対する応答が調べられている。
Ozone-induced expression of the Arabidopsis FAD7 gene requires salicylic acid, but not NPR1 and SID2. Yaeno T, Saito B, Katsuki T, Iba K. Plant Cell Physiol. 2006 Mar;47(3):355-62. Epub 2006 Jan 13. PMID: 16415067
Table 1 にサリチル酸の蓄積量のデータがある。短時間（８時間）のオゾン処理で増加している。主要な生合成遺伝子である sid2 (=ics1) を破壊した植物でも配糖体型のサリチル酸の蓄積量は０ではなくかなりの量が含まれ、オゾン処理で増加が見られている。
植物にグリセロールを与えるとサリチル酸の量が大きく増加するという論文がある。 Plant Physiol. 2005 Dec; 139(4): 1717–1735. doi: 10.1104/pp.105.071662 PMCID: PMC1310554 PMID: 16306139 Role of Salicylic Acid and Fatty Acid Desaturation Pathways in ssi2-Mediated Signaling
グリセロールは細胞内でグリセロール３リン酸になり、この化合物に植物免疫を活性化する作用がある。 Plant Signal Behav. 2011 Nov 1; 6(11): 1871–1874. doi: 10.4161/psb.6.11.17901 PMCID: PMC3343732 PMID: 22067992 Glycerol-3-phosphate and systemic immunity https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3343732/
植物では、グリセロール３リン酸はプラスチドに取り込まれて脂肪酸生合成に使われる。それだけでなく、グリセロール３リン酸シャトル機構によって細胞質側に存在する NADH からの電子をミトコンドリア電子伝達系へ流し込む働きも持ち合わせている。細胞質に存在するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼがジヒドロキシアセトンリン酸 DHAP を、NADH の還元力を用いて還元し、グリセロール３リン酸が生成する。グリセロール３リン酸はミトコンドリア内膜に局在するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼによって酸化され DHAP に戻る。この際にグリセロール３リン酸からの電子がユビキノンに渡されることによって、細胞質側に存在する NADH からの電子をミトコンドリア電子伝達系へ流し込むことができる。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1356549/ Involvement of a glycerol-3-phosphate dehydrogenase in modulating the NADH/NAD+ ratio provides evidence of a mitochondrial glycerol-3-phosphate shuttle in Arabidopsis. Shen W, Wei Y, Dauk M, Tan Y, Taylor DC, Selvaraj G, Zou J. Plant Cell. 2006 Feb;18(2):422-41. Epub 2006 Jan 13. PMID: 16415206
この論文の Fig.9 のデータは興味深い。AOX タンパク質の量は様々なストレス、ミトコンドリア機能障害によって増加する。しかし gpdhc1 変異体（At2g41540）では AOX タンパク質の量が減少している。これは珍しい変化である。変異のせいで電子伝達系に電子が流れこみにくくなったせいかもしれない。
Plastidial fatty acid levels regulate resistance gene-dependent defense signaling in Arabidopsis. Chandra-Shekara AC, Venugopal SC, Barman SR, Kachroo A, Kachroo P. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Apr 24;104(17):7277-82. Epub 2007 Apr 12.PMID: 17431038
グリセロールを与えると 18:1 脂肪酸の量が減少する。
GSE26973 にマイクロアレイのデータがある。見てみるとなぜか鉄欠乏応答が強く起きている。
トリパノゾーマでは、グリセロールは anaerobic energy metabolism 解糖系によるグルコースからのエネルギー生産を阻害する作用があると書かれている。
Alternative oxidase inhibitors: Mitochondrion-targeting as a strategy for new drugs against pathogenic parasites and fungi Med Res Rev. 2019 Sep;39(5):1553-1602. Godwin U Ebiloma など PMID: 30693533 DOI: 10.1002/med.21560
Proline induces calcium-mediated oxidative burst and salicylic acid signaling Amino Acids. 2011 May;40(5):1473-84. doi: 10.1007/s00726-010-0757-2. Epub 2010 Oct 2. Jiugeng Chen など PMID: 20890619 DOI: 10.1007/s00726-010-0757-2
過剰のプロリンを植物に与えると生育が抑制される。Fig. 4B に 結合型でないサリチル酸の量を測定したデータがある。10 mM Pro で二倍以上、45 mM で三倍くらいに増加している。SA 誘導性の PR1 遺伝子の mRNA蓄積量が増加している。
22.5 mM のプロリンと低濃度（10μM）のサリチル酸を同時に与えると、相乗的に生育を強く抑制する。
グリセロール３リン酸の場合のように、プロリンの一部はミトコンドリアで働く酵素 Proline Dehydrogenase で代謝され、その際に放出された電子が電子伝達系に流れこむ。この際に活性酸素が発生することがある。過剰の電子を処分するために Alternative oxidase が働くので、プロリンに耐えるために AOX が重要な役割を果たしている。
Alternative oxidase (AOX) 1a and 1d limit proline-induced oxidative stress and aid salinity recovery in Arabidopsis. Oh GGK, O'Leary BM, Signorelli S, Millar AH. Plant Physiol. 2022 Mar 4;188(3):1521-1536. doi: 10.1093/plphys/kiab578. PMID: 34919733
普通 AOX1a が主要なアイソフォームだが、プロリンを与えた際は AOX1d も強く働いている。AOX1a と 1d の両方を欠損した変異体ではプロリンによる酸化ダメージが大きくなる。植物が塩ストレスから回復する際にはプロリンの酸化が活発に起きる。AOX1a と 1d の両方を欠損した変異体では、塩ストレスからの回復(光合成活性の)が遅くなる。ストレスからの回復に AOX1a, 1d が果たす役割が示された。 厳しい自然界ではストレスとそこからの回復が何回も繰り返し起きるだろうから、この論文で示された仕組みが重要な役割を持っているのかもしれない。
Proline oxidation fuels mitochondrial respiration during dark-induced leaf senescence in Arabidopsis thaliana. Launay A, Cabassa-Hourton C, Eubel H, Maldiney R, Guivarc'h A, Crilat E, Planchais S, Lacoste J, Bordenave-Jacquemin M, Clément G, Richard L, Carol P, Braun HP, Lebreton S, Savouré A. J Exp Bot. 2019 Nov 18;70(21):6203-6214. doi: 10.1093/jxb/erz351. PMID: 31504781
セネッセンスが起きる際にはエネルギー源が光合成から別のもの、例えばデンプンが分解して生じた単糖、タンパク質が分解して生じたアミノ酸、貯蔵脂質が分解して生じた脂肪酸などに切り替わる。その際ミトコンドリアは重要な役割を果たす。この論文では、プロリンの酸化が重要な役割を果たしていることを示している。Proline dehydrogenase 1 At3g30775 は EARLY RESPONSIVE TO DEHYDRATION 5 ERD5 としても知られているが、セネッセンス、葉の暗黒処理でも mRNA 量が増加する。Proline dehydrogenase 2 At5g38710 はセネッセンス、暗黒処理、サリチル酸、乾燥などで mRNA 量が増加する。
Pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase is an essential enzyme for proline dehydrogenase function during dark-induced senescence in Arabidopsis thaliana Plant Cell Environ. 2022 Dec 30. doi: 10.1111/pce.14529. Yao Zheng など PMID: 36583533
セネッセンスが進行する際にはエネルギー源が変化する。プロリンの代謝が重要になる。
Alternative oxidase 1a and 1d enable metabolic flexibility during Ala catabolism in Arabidopsis. Oh GGK, Kumari V, Millar AH, O'Leary BM. Plant Physiol. 2023 Aug 3;192(4):2958-2970. doi: 10.1093/plphys/kiad233. PMID: 37128995
グリセロール、プロリンを大量に与えると上に書いたようにミトコンドリアのユビキノンに電子を過剰に流し込むことになる。それによって活性酸素が発生してサリチル酸が増えると想像することはできる。セネッセンスでサリチル酸が増加するのもこのことが関係しているかもしれない。しかしその考えに反するような実験結果もあるのでそんな単純に考えることはできないだろう。
Naringenin Induces Pathogen Resistance Against Pseudomonas syringae Through the Activation of NPR1 in Arabidopsis Front Plant Sci. 2021 May 20;12:672552. doi: 10.3389/fpls.2021.672552. eCollection 2021. Jonguk An など PMID: 34093630 PMCID: PMC8173199
Naringenin は植物が生合成するプラボノイドの一種である。Naringenin を与えると PR1 遺伝子の発現量が大きく増大して Pst DC3000 に対する抵抗性が高くなった。NPR1 タンパク質がオリゴマーからモノマーに変化していた。Abiocode という会社が製造した抗 NPR1 抗体を使っている。サリチル酸の蓄積量は2倍くらいに増加した（遊離型だけを測定していて、配糖体の分解は行っていない）。
Quercetin induces pathogen resistance through the increase of salicylic acid biosynthesis in Arabidopsis. An J, Kim SH, Bahk S, Le Anh Pham M, Park J, Ramadany Z, Lee J, Hong JC, Chung WS. Plant Signal Behav. 2023 Dec 31;18(1):2270835. doi: 10.1080/15592324.2023.2270835. Epub 2023 Oct 30. PMID: 37902267
ケルセチンは健康によいことが知られているフラボノイドである。植物においてもストレス耐性を高めるという報告がある。
芽生えを 3 時間ケルセチンで処理すると NPR1 タンパク質（重合体を形成している）がモノマー化した（Fig. 2a）。芽生えを 3 時間ケルセチンで処理すると NPR1 タンパク質は核に移行した（Fig. 2b）。ICS1 の発現量が増大してサリチル酸の量が二倍に増加した。
Chemical Activation of EDS1/PAD4 Signaling Leading to Pathogen Resistance in Arabidopsis. Joglekar S, Suliman M, Bartsch M, Halder V, Maintz J, Bautor J, Zeier J, Parker JE, Kombrink E. Plant Cell Physiol. 2018 Aug 1;59(8):1592-1607. doi: 10.1093/pcp/pcy106. PMID: 29931201
この論文では病原菌感染やサリチル酸で強く活性化する At1g19250 FMO1 flavin-dependent monooxygenase 1 のプロモーターの下流に YFP 黄色蛍光タンパク質を連結したものをレポーター遺伝子として、プロモーターを活性化する化合物をスクリーニングした。スクリーニングには 96-well microplates （液体培地）で 14 日間育成した芽生えを用いた。そこに化合物または溶媒を与え 3-6 日間後に観察する。
活性化合物の一つとして Thaxtomin が発見された。Thaxtomin は 「ジャガイモそうか病」を引き起こす放線菌が作る、非常に重要な毒素でセルロース合成を阻害する。 Thaxtomin A: evidence for a plant cell wall target Fry BA and Loria R. (2002) Physiological and Molecular Plant Pathology. 60: 1-8. シロイヌナズナの培養細胞で PCD を引き起こす。 Thaxtomin A induces programmed cell death in Arabidopsis thaliana suspension-cultured cells. Duval I, Brochu V, Simard M, Beaulieu C, Beaudoin N. Planta. 2005 Nov;222(5):820-31. Epub 2005 Jul 15.
Fig. 4a を見るとサリチル酸の蓄積量が大きく増大している（24時間処理）。PR1 などの mRNA 量も大きく増加している。
植物に与える窒素源として硝酸、アンモニア、尿素などの形態がある。アンモニアを与えると生育が悪くなる植物と、そうでない植物があり研究が進んでいる。例： Nitrogen Source Dependent Changes in Central Sugar Metabolism Maintain Cell Wall Assembly in Mitochondrial Complex I-Defective frostbite1 and Secondarily Affect Programmed Cell Death. Podgórska A, Ostaszewska-Bugajska M, Tarnowska A, Burian M, Borysiuk K, Gardeström P, Szal B. Int J Mol Sci. 2018 Jul 28;19(8). pii: E2206. doi: 10.3390/ijms19082206. PMID: 30060552 窒素源の種類は二次的に様々な影響を与える。 Ammonium regulates Fe deficiency responses by enhancing nitric oxide signaling in Arabidopsis thaliana. Zhu XF, Dong XY, Wu Q, Shen RF. Planta. 2019 Jun 5. doi: 10.1007/s00425-019-03202-6. [Epub ahead of print] PMID: 31168664 「アンモニアを与えると鉄欠乏ダメージを緩和できる」と書かれている。この論文では鉄欠乏応答に対するアンモニアの影響を調べている。鉄欠乏状態（窒素源は硝酸イオン）では一酸化窒素の量が増える。そこにアンモニアを与える（硝酸イオンとアンモニウムイオンが共存）と一酸化窒素の量がもっと増える。一酸化窒素は細胞壁のヘミセルロースに結合している鉄を取り込みやすくする。また鉄取り込みに関わる遺伝子の発現を活性化する。それらの効果によって鉄欠乏ダメージ（窒素源が硝酸イオンのみの状態で強くなる）を緩和できる。イントロダクションには「アンモニウムイオンはストレス応答を活性化する作用もある」と書かれている。
アンモニアを窒素源とすることで植物の成長が抑えられることに関する、すばらしい成果が日本の研究グループから発表された。
Excessive ammonium assimilation by plastidic glutamine synthetase causes ammonium toxicity in Arabidopsis thaliana. Hachiya T, Inaba J, Wakazaki M, Sato M, Toyooka K, Miyagi A, Kawai-Yamada M, Sugiura D, Nakagawa T, Kiba T, Gojon A, Sakakibara H. Nat Commun. 2021 Aug 16;12(1):4944. doi: 10.1038/s41467-021-25238-7. PMID: 34400629 名古屋大学のプレスリリース 「植物のアンモニウム毒性の原因を解明 〜将来の高CO2環境に適した作物の開発に期待〜」
アンモニアを窒素源にすると細胞内外の水素イオン濃度が高くなり pH が低下する。そのため ALMT1, GABA-T, GAD1, GDH2, PGIP1, PGIP2 などの酸で誘導される遺伝子群の発現量が増加する。これらの遺伝子の産物、また硝酸還元酵素は水素イオンを消費することができるのでアンモニア毒性に対抗する働きがある。培地にアンモニア水を加えて pH を上げることでアンモニア毒性を打ち消すことができている。アンモニウムイオンが直接ダメージを強く与えるのではなく、アンモニアを同化する際に水素イオン濃度が高くなってしまうのが植物の生育によくなかったと言うことになる。 PGIP というタンパク質は細胞壁のペクチンが酸で分解するのを抑えることで細胞壁を安定化するのでアンモニア毒性を緩和できる。マイクロアレイのデータ (.cel ファイル) E-MTAB-10796 https://www.omicsdi.org/dataset/arrayexpress-repository/E-MTAB-10796 が公開されている。
上に書いた論文が出版される以前に、様々な研究、説が出現していた。
Differential Effects of Nitrogen Forms on Cell Wall Phosphorus Remobilization Are Mediated by Nitric Oxide, Pectin Content, and Phosphate Transporter Expression. Zhu CQ, Zhu XF, Hu AY, Wang C, Wang B, Dong XY, Shen RF. Plant Physiol. 2016 Jun;171(2):1407-17. doi: 10.1104/pp.16.00176. Epub 2016 Apr 15. PMID: 27208223 窒素源が硝酸イオンだけの状態では栄養不良になりやすくなるらしい。
サリチル酸の蓄積量は植物の種類によって大きく異なる。アンモニウムイオンの影響も植物によって異なるかもしれない。 「アンモニアと植物 - 過剰下における代謝変動-」 松本英明先生による解説 化学と生物 vol.13(3), 198 ページ https://iss.ndl.go.jp/books/R000000004-I1590389-00?locale=en
こういう論文もあった。Enhanced Formation of Methylglyoxal-Derived Advanced Glycation End Products in Arabidopsis Under Ammonium Nutrition. Borysiuk K, Ostaszewska-Bugajska M, Vaultier MN, Hasenfratz-Sauder MP, Szal B. Front Plant Sci. 2018 May 24;9:667. doi: 10.3389/fpls.2018.00667. eCollection 2018. PMID: 29881392 アンモニアを窒素源にするとトリオースリン酸からメチルグリオキサールが生成しやすくなる。メチルグリオキサールは様々なタンパク質を修飾してダメージを与える。
アンモニア毒性については、生理生態学の見地から優れた研究が進んでいる。 http://www.bs.s.u-tokyo.ac.jp/~seitaipl/personal/hachiya/hachiya.html 蜂谷博士の研究成果 主要因と二次的な影響を判別することの重要性が強調されている。サリチル酸は二次的な影響を受けるのだろうが、窒素源の種類を変えることによってサリチル酸の蓄積量が制御できるかもしれない。
The ammonium/nitrate ratio is an input signal in the temperature-modulated, SNC1-mediated and EDS1-dependent autoimmunity of nudt6-2 nudt7. Wang H, Lu Y, Liu P, Wen W, Zhang J, Ge X, Xia Y. Plant J. 2013 Jan;73(2):262-75. doi: 10.1111/tpj.12032. Epub 2012 Nov 8. PMID: 23004358
窒素源の比率が病原体応答に影響を与える。しかし nudt という因子の変異体でのことである。Figure 8 に興味深いデータがある。二重変異体は防御応答が活性化しやすい。22度で培養土で育成した場合、生育が停止してしまう。しかし28度で培養土で育成した場合は正常に生育できる（Figure 2）。サリチル酸の蓄積量も同様に温度で変化し22度で大きく増加する。
培養土ではなく、MS 寒天培地（ショ糖を 3 % 含む）では22度で正常に生育できる。窒素源の比率が１：１では野生型と成長に差がない。またアンモニウムイオンを主体にした際も差がない。しかし硝酸イオンを主体にすると野生型よりも成長が悪くなり、PR1 遺伝子が強く発現している。そのとき一酸化窒素の量が増大して EDS1 という防御応答を活性化する因子を活性化する。アンモニウムイオンを取り除くと亜硝酸イオンと一酸化窒素の量が増える。アンモニウムイオンを主体にした際は野生型も二重変異体もクロロフィルが減少している。
NH4+ protects tomato plants against Pseudomonas syringae by activation of systemic acquired acclimation. Fernández-Crespo E, Scalschi L, Llorens E, García-Agustín P, Camañes G. J Exp Bot. 2015 Nov;66(21):6777-90. doi: 10.1093/jxb/erv382. Epub 2015 Aug 5. PMID: 26246613
これはトマトを用いている。アンモニアを窒素源にすると Pseudomonas syringae に対して強くなる。この菌に対する耐性と SA の量には多くの場合相関がある。 Fig. 5 にホルモン量のデータがある。アンモニアが窒素源では約 2 倍に増加しているように見えるがばらつきが大きい。感染時には違いがなくなる。
The form of nitrogen nutrition affects resistance against Pseudomonas syringae pv. phaseolicola in tobacco. Gupta KJ, Brotman Y, Segu S, Zeier T, Zeier J, Persijn ST, Cristescu SM, Harren FJ, Bauwe H, Fernie AR, Kaiser WM, Mur LA. J Exp Bot. 2013 Jan;64(2):553-68. doi: 10.1093/jxb/ers348. Epub 2012 Dec 10. PMID: 23230025
これはタバコを用いている。これも Pseudomonas syringae に対する感受性を見ている。Fig. 3B にサリチル酸の蓄積量を測定したデータがある。菌感染処理後 4hr では塩化アンモニウムを窒素源とした方が少しサリチル酸が増加しているように見える。差は小さい。 24hr では菌感染処理でサリチル酸の蓄積量が大きく増加する。このときは硝酸カリウムを窒素源とした方が大きく増加する。 著者らは一酸化窒素 NO の量に注目している。硝酸イオンを窒素源にすると亜硝酸から一酸化窒素が発生する。アンモニアのみが窒素源の状態では一酸化窒素が発生しにくい。 一酸化窒素の定量には、Quantum cascade laser (QCL) で発生した光を、有効長が 76 m もある光路に通過させて一酸化窒素の弱い吸収を特異的に検出している。
シロイヌナズナでは、アンモニウムイオンを窒素源にしてもサリチル酸の蓄積量は変化しないという論文がある。
Arabidopsis nitrate reductase activity is stimulated by the E3 SUMO ligase AtSIZ1. Park BS, Song JT, Seo HS. Nat Commun. 2011 Jul 19;2:400. doi: 10.1038/ncomms1408. PMID: 21772271
Fig. 8C, D にサリチル酸の蓄積量の測定結果がある。siz1-2 変異体はサリチル酸の蓄積量が多い。野生型は窒素源が KNO3 でも (NH4)2SO4 でも量に変化はない。siz1-2 変異体では (NH4)2SO4 を窒素源にすると野生型と同じ量に低下する。Fig. 1 の写真を見ると、siz1 変異体は窒素源が硝酸イオンのみの条件では生育が悪くなっている。 野生型は窒素源の種類による影響を受けにくい。siz1 変異によって窒素源の種類に対する感受性が生じている。
Balancing of B6 Vitamers Is Essential for Plant Development and Metabolism in Arabidopsis. Colinas M, Eisenhut M, Tohge T, Pesquera M, Fernie AR, Weber AP, Fitzpatrick TB. Plant Cell. 2016 Feb;28(2):439-53. doi: 10.1105/tpc.15.01033. Epub 2016 Feb 8. PMID: 26858304
「exogenous ammonium rescues the growth and developmental phenotype」と書かれている。Fig.5 にアミノ酸、有機酸、糖の量を測定したグラフがある。倍率しか出されていないが、サリチル酸の蓄積量が大きく増加している。 ビタミン B6 の一種であるピリドキサールリン酸 (PLP) は、様々なアミノ酸代謝酵素の補酵素として働く。 その同族体のピリドキサミンリン酸（PMP）が変異で増えると硝酸還元を阻害する。そのため硝酸イオンだけでは生育が悪くなっている。アンモニウムイオンを加えると回復する。
Actin depolymerization is able to increase plant resistance against pathogens via activation of salicylic acid signalling pathway. Leontovyčová H, Kalachova T, Trdá L, Pospíchalová R, Lamparová L, Dobrev PI, Malínská K, Burketová L, Valentová O, Janda M. Sci Rep. 2019 Jul 18;9(1):10397. doi: 10.1038/s41598-019-46465-5. PMID: 31320662
アクチンで構成される細胞骨格には様々なオルガネラ、酵素などが結合し支持されている。そのためアクチンが脱重合すると様々なことが起きるのだろう。
例： The Molybdenum Cofactor Biosynthesis Network: In vivo Protein-Protein Interactions of an Actin Associated Multi-Protein Complex. Kaufholdt D, Baillie CK, Meinen R, Mendel RR, Hänsch R. Front Plant Sci. 2017 Nov 14;8:1946. doi: 10.3389/fpls.2017.01946. eCollection 2017. PMID: 29184564
Disrupted actin: a novel player in pathogen attack sensing? New Phytol. 2020 Sep;227(6):1605-1609. doi: 10.1111/nph.16584. Epub 2020 May 13. Hana Leontovyčová など PMID: 32259281
この論文に「PR2 expression could be a good marker, as it is induced after the chemical disruption of actin independently of SA (Kalachova et al., 2019),」と書かれている。 Identification of salicylic acid-independent responses in an Arabidopsis phosphatidylinositol 4-kinase beta double mutant Tetiana Kalachova など Annals of Botany, Volume 125, Issue 5, 8 April 2020, Pages 775–784, https://academic.oup.com/aob/article/125/5/775/5524547?login=false
最近細胞内の Molecular condensates の研究が注目されている。サリチル酸の働きにも関与している。
細胞生物学：凝集体を増大させたり縮小させたりする生化学的タイマー 2022年9月15日 Nature 609, 7927 doi: 10.1038/d41586-022-01794-w 「細胞の内部は、液滴のように凝縮する動的構造の助けを借りて組織化されている。今回、細胞はタイミング戦略を使って、こうした凝集体の制御されない成長を避けて健全な機能を確実に維持していることが明らかになった。」 という記事があった。 それを見ると、生成した分子凝集体にはアクチン繊維が入り込み、一定の時間が過ぎるとアクチンの作用で凝集体が分解するという図が書かれている。
Guanosine tetraphosphate modulates salicylic acid signalling and the resistance of Arabidopsis thaliana to Turnip mosaic virus Mol Plant Pathol. 2018 Mar;19(3):634-646. doi: 10.1111/mpp.12548. Epub 2017 Mar 27. Hela Abdelkefi など PMID: 28220595 PMCID: PMC6638062 Fig. 4D にサリチル酸の量のデータがある。少ししか増加していない。PR-1 の mRNA 量は 10 倍くらい増加している。 マイクロアレイデータ GSE62656 が公開されている。
Complete loss of RelA and SpoT homologs in Arabidopsis reveals the importance of the plastidial stringent response in the interplay between chloroplast metabolism and plant defense response. Inazu M, Nemoto T, Omata Y, Suzuki S, Ono S, Kanno Y, Seo M, Oikawa A, Masuda S. Plant Cell Physiol. 2023 Oct 31:pcad136. doi: 10.1093/pcp/pcad136. PMID: 37925598
ゲノム編集によって RSH 遺伝子（RelA-SpoT homologs, 4つある）の4重変異体を作成した。それによって ppGpp の量を十分に減らした。窒素十分条件でも4重変異体ではサリチル酸の量が約２倍に増加した。窒素十分条件から窒素欠乏に移した場合、4重変異体でのサリチル酸の量が増加がさらに強められた。この際 IAA, ABA, JA, JA-Ile の量も増加していた (Fig. 7)。
Characterization of Disease Resistance Induced by a Pyrazolecarboxylic Acid Derivative in Arabidopsis thaliana. Yasuda M, Fujita M, Soudthedlath K, Kusajima M, Takahashi H, Tanaka T, Narita F, Asami T, Maruyama-Nakashita A, Nakashita H. Int J Mol Sci. 2023 May 20;24(10):9037. doi: 10.3390/ijms24109037. PMID: 37240381
CMPA は PR1, PR2, PR5 の遺伝子発現を活性化して抗菌性を高める。しかしサリチル酸の量はほとんど増加していなかった（Fig. 3）。サリチル酸生合成変異体 sid2, サリチル酸代謝酵素発現株 NahG でも CMPA の効果は見られた。しかし npr1 変異体では効果が見られなくなった (Fig. 4 and 5)。
Volatile Compounds Emitted by Plant Growth-Promoting Fungus Tolypocladium inflatum GT22 Alleviate Copper and Pathogen Stress Plant Cell Physiol. 2023 Oct 17:pcad120. doi: 10.1093/pcp/pcad120. Chih-Yun Chiang など PMID: 37951591
カビから放出される揮発性化合物のうちで limonene が効いていると推定している。
SARD1, Calmodulin-Binding Protein 60G (CBP60g) and Isochorismate Synthase 1 (ICS1) 等の転写産物量が増加している。同時に hypoxia-related genes の転写産物量も増加している。
データが GSE239841 で公開されている。
このことについては、岡山大学の能年先生によるすばらしい解説が公開されている。 http://ousar.lib.okayama-u.ac.jp/ja/52126 「植物免疫プライミング剤の単離と作用機序解明」 プラントアクティベーターと呼ばれることもある。病原菌応答が常に起きていると植物の生長は強く阻害されてしまう。それではいくら病原菌に強くなっても意味がない。わずかな病原菌の感染に対応してできるだけ速やかに強い抗菌応答が起きることが望ましい。イネではプロベナゾールという化合物が明治製菓によって免疫プライミング剤として開発され実用化されている。
「植物の生長調節」2018, 53-1 では、石濱、白須両先生による「植物微生物相互作用におけるサリチル酸生合成と代謝」というすばらしい解説が掲載されていた。プラントアクティベーターに関しても解説がある。
「病害応答に働くサリチル酸の生合成およびシグナル伝達の制御機構に関する研究」 草島先生による、植物化学調節学会奨励賞受賞解説 植物の生長調節 Vol56 No.1 1-6, 2021 というすばらしい解説が掲載されている。
「植物ホルモンによる植物保護の新展開」 中村英光先生によるすばらしい解説 日本農薬学会誌/47 巻 (2022) 2 号 https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjpestics/47/2/47_W22-30/_article/-char/ja サリチル酸とストリゴラクトンの関係についても解説されている。
Chemical priming of plant defense responses to pathogen attacks. Hönig M, Roeber VM, Schmülling T, Cortleven A. Front Plant Sci. 2023 May 8;14:1146577. doi: 10.3389/fpls.2023.1146577. eCollection 2023. PMID: 37223806 という論文があった。
Molecular evolution of methylesterase family genes and the BnMES34 is a positive regulator of Plasmodiophora brassicae stress responses in Arabidopsis Int J Biol Macromol. 2024 Jan 11:129333. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2024.129333. Ruimin Jia など PMID: 38218279
サリチル酸は水酸化、グルコシル化、メチル化などの修飾を受ける。この論文ではサリチル酸メチルをサリチル酸に戻すメチルエステラーゼを強く働かせると、病原菌感染時のサリチル酸の量が少し増え、抵抗性が高まることを示している (fig. 10)。菌が感染していない状態では、生育に対する影響はない。
Potentiation of pathogen-specific defense mechanisms in Arabidopsis by beta -aminobutyric acid Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7;97(23):12920-5. doi: 10.1073/pnas.230416897. L Zimmerli 1 , G Jakab, J P Metraux, B Mauch-Mani PMID: 11058166 PMCID: PMC18865
Fig. 2 に PR-1 の発現量を見たデータがある。BABA 単独ではほとんど増加していない。しかし菌感染時に BABA が存在するとすばやく、強く増加するというプライミング作用を示している。
Chemical priming of immunity without costs to plant growth. Buswell W, Schwarzenbacher RE, Luna E, Sellwood M, Chen B, Flors V, Pétriacq P, Ton J. New Phytol. 2018 May;218(3):1205-1216. doi: 10.1111/nph.15062. Epub 2018 Feb 21. PMID: 29465773 という論文では、BABA と類似した beta-homoserine にもプライミング作用があり、生育を阻害しないので有用であると書かれている。 A single amino acid transporter controls the uptake of priming-inducing beta-amino acids and the associated tradeoff between induced resistance and plant growth. Tao CN など Plant Cell. 2022 Nov 29;34(12):4840-4856. doi: 10.1093/plcell/koac271. PMID: 36040205 という論文も出版されている。
Strigolactones Modulate Salicylic Acid-Mediated Disease Resistance in Arabidopsis thaliana. Kusajima M, Fujita M, Soudthedlath K, Nakamura H, Yoneyama K, Nomura T, Akiyama K, Maruyama-Nakashita A, Asami T, Nakashita H. Int J Mol Sci. 2022 May 8;23(9):5246. doi: 10.3390/ijms23095246. PMID: 35563637
人工ストリゴラクトンである GR24 処理ではサリチル酸誘導性遺伝子の発現量は上昇しない。PR1 はかえって低下している（Fig. 5）。しかし GR24 を前処理して 3 日後に細菌 Pst を感染させた際の PR1 の発現量が早い時期から増大した。
薬剤の効果を正しく見るには、与える方法、与える生育段階、与える器官、与える期間、与える際の環境条件などをうまく設定しないといけない。これは難しい。
この実験では、 Three-week-old plants were treated with 0.02% acetone (control) or 10 µM GR24 by drenching the soil 3週間目の植物体を育成している培養土に GR24 を含む水を与えている。
The MAX2-KAI2 module promotes salicylic acid-mediated immune responses in Arabidopsis. Zheng X, Liu F, Yang X, Li W, Chen S, Yue X, Jia Q, Sun X. J Integr Plant Biol. 2023 Feb 4. doi: 10.1111/jipb.13463. Online ahead of print. PMID: 36738234 という論文があった。 MAX2 は KARRIKIN INSENSITIVE 1 という名前でも呼ばれストリゴラクトン、カリキン応答に働く。KAI2 はカリキンと結合する。Fig. 6 に野生型と max2-2 の遺伝子発現を比較した結果がある。普通に生育している状態の max2-2 では SARD1, CBP60g, WRKY54 などのサリチル酸作用に関わる遺伝子の mRNA蓄積量が低下している。しかし菌が感染した後の誘導はかえって強くなることもある。 Fig. 7 にも ICS1, PBS3, PR1 等について同様な結果が示されている。
プライミングと、呼吸量（酸素消費量）に関連があるという論文があった。
Oxygen transfer rate identifies priming compounds in parsley cells BMC Plant Biol. 2015 Nov 25;15:282. Jana Viola Schilling など PMID: 26608728 PMCID: PMC4660667 DOI: 10.1186/s12870-015-0666-3
Respiration activity-monitoring system (RAMOS) というものを使っている。 このシステムは oxygen transfer rate (OTR) を非侵襲的に測定できる。サリチル酸に OTR を増やす働きがある。この論文での「プライミング」という言葉の意味が少し違うかもしれない。パセリの培養細胞について、酸素センサーでフラスコ内の酸素分圧を測定している。
酸素消費量が増加する要因としては「NADPH oxidase が活性化して活性酸素を大量に生成するので酸素を消費する」という説と、「ミトコンドリアの AOX 経路が活性化するので酸素消費が増える」という説があると書かれている。「ミトコンドリアの CytC 経路が活性化」でもよいような気もする。また他にも酸素を消費する経路はあるだろう。 Dual and Opposing Roles of Xanthine Dehydrogenase in Defense-Associated Reactive Oxygen Species Metabolism in Arabidopsis. Ma X, など Plant Cell. 2016 May;28(5):1108-26. doi: 10.1105/tpc.15.00880. Epub 2016 May 5. PMID: 27152019 XDH はキサンチンを尿酸に変えるのが本来の活性だが、NADH から酸素分子に電子を渡して superoxide を作る反応も触媒すると書いてあった。
An illuminated respiratory activity monitoring system identifies priming-active compounds in plant seedlings BMC Plant Biol. 2021 Jul 5;21(1):324. Judith Loogen など PMID: 34225655 DOI: 10.1186/s12870-021-03100-8
この論文ではシロイヌナズナの芽生えを用いて測定できるように装置を改良している。 Fig. 4 を見るとまず溶液を加えたショックで OTR が大きく上がる。その後下がってくる。この場合サリチル酸は効果がない。エリシター flg22 で OTR が大きく上がる。Fig. 5 では Tyr020 というプライミング分子を同時に加えている。Tyr020 によって flg22 の効果が強くなる。
酸素濃度の測定には、蛍光・燐光の強度、蛍光・燐光が消失するまでの時間が酸素濃度によって変化するという現象を用いている。この原理による酸素濃度測定については様々な分野で使われていて検索するとたくさん見つかる。シェイカーや恒温槽などで有名なタイテックが、プレセンス社のセンサーを取り扱っている。それ以外にも「蛍光プレートリーダーを使用して溶存酸素を測定できる96ウェルセンサープレートです（消耗品）。」という製品もある。このタイプは校正が必要だが、植物の呼吸による酸素濃度の相対的な時間変化を測るだけなら問題ないかもしれない。
蛍光・燐光と酸素濃度： https://www.jst.go.jp/sentan/result/seika2012/01_05.html 「イリジウム錯体のりん光を用いて、癌などの低酸素組織をイメージングする方法を開発」 「りん光は蛍光と異なり寿命が長く、周囲の酸素分子との衝突により顕著な消光を受けやすい」と書かれている。 https://www.jstage.jst.go.jp/article/faruawpsj/53/3/53_220/_pdf 「りん光寿命計測による細胞組織内酸素濃度測定」 酸素分子は反応性の高い電子軌道を持っている。励起されて高いエネルギーを持つ状態の蛍光・燐光物質は本来は光を発してエネルギーを失うが、酸素分子がたくさんあると光を発生せずにエネルギーを酸素分子に渡すことでエネルギーを失う。窒素や二酸化炭素は反応性がないので影響しない。水分子はどうなのだろうか。酸素以外の影響が少ない物質を選ぶのだろう。スイッチの位置などの目印として、燐光を発生する物質をしみこませたテープが売られている。これを酸素濃度の変化の検出に使えたら都合がよい。
装置の作成に関する論文： 細い光ファイバーの先端に蛍光（燐光）物質をつけることで、マイクロプレートで使えるようにしている。蛍光（燐光）が消失するまでの時間を測るので、難しい光路系を作る必要がないらしい。ウェル内の空気を定期的に入れ換えるためのマイクロバルブをウェルごとに設置してある。それに工夫があるのだろう。
Flitsch D, Krabbe S, Ladner T, Beckers M, Schilling J, Mahr S, et al. Respiration activity monitoring system for any individual well of a 48-well microtiter plate. J Biol Eng. 2016;10:14. https://doi.org/10.1186/s13036-016-0034-3 Biochem Eng J. 2001 Mar;7(2):157-162. Device for sterile online measurement of the oxygen transfer rate in shaking flasks T Anderlei など PMID: 11173305 DOI: 10.1016/s1369-703x(00)00116-9
Mitochondrial Stress Induces Plant Resistance Through Chromatin Changes Front. Plant Sci., 22 September 2021 | https://doi.org/10.3389/fpls.2021.704964 Ana López Sánchez など
この論文では電子伝達複合体 III をアンチマイシンで阻害することで病原細菌に対する抵抗性が高くなることを示している。そのことを mitochondrial stress-induced pathogen resistance (MS-IR) と名付けている。この場合は ahg2 とは異なり、サリチル酸の量が増加しないと書かれている。しかし SA 作用に重要なタンパク質である npr1 が必要であることも示されている。ヒストンの修飾の変化によるクロマチン構造の変化が起きている。
アンチマイシン処理は AOX1a 遺伝子の葉での発現を強く誘導する。PR-1 遺伝子の発現はアンチマイシン処理だけでは増加しないが、菌が感染したことによる発現誘導が、アンチマイシン処理をすると早い段階で強く上がるようになった。このことをアンチマイシンのプライミング作用と呼んでいる。
Studies on the mechanism of agricultural chemicals focused on plant hormone signals J Pestic Sci. 2019 Jul 25;44(4):270-274. Miyuki Kusajima PMID: 31777446 PMCID: PMC6861430 DOI: 10.1584/jpestics.J19-05
Characterization of plant immunity-activating mechanism by a pyrazole derivative. Kusajima M, Fujita M, Yamakawa H, Ushiwatari T, Mori T, Tsukamoto K, Hayashi H, Maruyama-Nakashita A, Che FS, Nakashita H. Biosci Biotechnol Biochem. 2020 Jul;84(7):1427-1435. doi: 10.1080/09168451.2020.1750341. PMID: 32281486
薬剤の効果を正しく見るには、与える方法、与える生育段階、与える器官、与える期間、与える際の環境条件などをうまく設定しないといけない。これは難しい。
Strigolactones Modulate Salicylic Acid-Mediated Disease Resistance in Arabidopsis thaliana. Kusajima M, Fujita M, Soudthedlath K, Nakamura H, Yoneyama K, Nomura T, Akiyama K, Maruyama-Nakashita A, Asami T, Nakashita H. Int J Mol Sci. 2022 May 8;23(9):5246. doi: 10.3390/ijms23095246. PMID: 35563637
この実験では、 Three-week-old plants were treated with 0.02% acetone (control) or 10 µM GR24 by drenching the soil 3週間目の植物体を育成している培養土を GR24 を含む水で drench 水浸しにして処理している。
Acibenzolar-S-Methyl Activates Stomatal-Based Defense Systemically in Japanese Radish. Sakata N, Ishiga T, Taniguchi S, Ishiga Y. Front Plant Sci. 2020 Oct 30;11:565745. doi: 10.3389/fpls.2020.565745. eCollection 2020. PMID: 33193493
この論文では、ダイコンを 9 cm のポットで育成した。光の周期は 16L/8D ASM という薬剤（50 % 乳液）を 100 ppm の水溶液にして、ポットごと植物体全体を dip 沈めて処理した。その後、4時間後または1日後または1週間後、菌 P.cannabina を感染させた。対照は、水に沈めて処理した。
Effect of Pretilachlor and Fenclorim on Growth and Glutathione S-Transferase Activity of Rice and Early Watergrass Weed Research, Japan Vol. 40 (3)163〜171 (1995) 雑 草 研 究 Fan Deng, Kenji Usui and Kozo Ishizuka
この論文では二通りの処理を行っている。種子から処理する場合、シャーレにろ紙を敷いて植物化学調節剤を含んだ水を注ぐ。そこに種子を播き、そのまま一週間育成して生重量と根の長さを見ている。幼植物に育った段階で処理する場合、まず本葉が1または2枚出た段階まで普通に育成する（水耕栽培で？）。植物化学調節剤を含む水に根を浸し24時間吸水させて処理する。そして（元に戻して）一週間育成して生重量を測定している。
Sulfanilamide Regulates Flowering Time through Expression of the Circadian Clock Gene LUX. Hirohata A, Yamatsuta Y, Ogawa K, Kubota A, Suzuki T, Shimizu H, Kanesaka Y, Takahashi N, Endo M. Plant Cell Physiol. 2022 May 16;63(5):649-657. doi: 10.1093/pcp/pcac027. PMID: 35238923
この論文では花成のタイミングを見るために、ポットに種まきして低温処理3日後22℃で育成したシロイヌナズナに定期的に 500 ml の処理液（12 mM の sulfanilamide, 葉酸生合成の阻害剤）を与えている。処理日は 5, 9, 12, 16, 19, 23, 26, 30, 33, 37, 40, 44, 47 日目と書かれている。この条件では花成が抑制され遅くなるが生育は全く悪くなっていない。
RNA-seq データが DRA011330 で公開されている。
Transcriptome analysis and identification of a transcriptional regulatory network in the response to H2O2. Hieno A, Naznin HA, Inaba-Hasegawa K, Yokogawa T, Hayami N, Nomoto M, Tada Y, Yokogawa T, Higuchi-Takeuchi M, Hanada K, Matsui M, Ikeda Y, Hojo Y, Hirayama T, Kusunoki K, Koyama H, Mitsuda N, Yamamoto YY. Plant Physiol. 2019 May 7. pii: pp.01426.2018. doi: 10.1104/pp.18.01426. [Epub ahead of print] PMID: 31064811
シロイヌナズナの芽生えを用いている。Abstract に、「 ABA accumulation is induced by H2O2 but SA is not,」と書かれている。Figure 2 のグラフを見ると、24時間後にはむしろ SA の蓄積量は有意に減少している。しかし、H2O2 が NPR1 を活性化して生じる SA 作用（H2O2 が NPR1 を直接活性化する）が ABA の増加に必要であると示されている。
Structural basis of NPR1 in activating plant immunity Nature. 2022 May 11. doi: 10.1038/s41586-022-04699-w. Shivesh Kumarなど PMID: 35545668 によると、NPR1 は過酸化水素で処理されると多量体を形成する (Fig. 2f)。
川北先生の総説 植物の生体防御機構における一酸化窒素の機能 - 日本生化学会 https://seikagaku.jbsoc.or.jp/10.14952/SEIKAGAKU.2016.880192/index.html には、NO が NPR1 タンパク質を S-ニトロソ化して細胞質に止める（SA 作用が起きない）と書かれている。過酸化水素と NO が正、負にそれぞれ作用することになる。
High air humidity dampens salicylic acid pathway and NPR1 function to promote plant disease. Yao L, Jiang Z, Wang Y, Hu Y, Hao G, Zhong W, Wan S, Xin XF. EMBO J. 2023 Sep 20:e113499. doi: 10.15252/embj.2023113499. Online ahead of print.PMID: 37728254
高い湿度では NPR1 protein ubiquitination and activity are decreased NPR1 タンパク質のユビキチン化と活性がどちらも低下する。「NPR1 protein turnover is reduced under high humidity」という見出しがある。高い湿度では細胞全体のユビキチン化タンパク質の量が減少する。高い湿度では「不活性な NPR1 タンパク質」が核に蓄積すると想定されている。
しかし「Deubiquitinases (DUBs) 脱ユビキチン化酵素の阻害剤はサリチル酸作用を打ち消す」という論文もある。ユビキチン化と NPR1 タンパク質の活性の調節は複雑であることが想像される。とても難しい問題なのだろう。
Associated data として GEO/GSE210893、GEO/GSE236463 がリンクされている。
Dynamic ubiquitination determines transcriptional activity of the plant immune coactivator NPR1. Skelly MJ, Furniss JJ, Grey H, Wong KW, Spoel SH. Elife. 2019 Oct 7;8:e47005. doi: 10.7554/eLife.47005. PMID: 31589140
この論文の figure supplement 1. に、脱ユビキチン化酵素 (DUB) の阻害剤はサリチル酸作用を打ち消すというデータがある。P22077 という化合物が特によく効いている。
P22077 は Activity-based chemical proteomics accelerates inhibitor development for deubiquitylating enzymes. Altun M, など Chem Biol. 2011 Nov 23;18(11):1401-12. doi: 10.1016/j.chembiol.2011.08.018. PMID: 22118674 という論文に最初に出てくる。動物細胞の USP7 という DUB に選択的に作用すると書かれている。
この論文の結果を逆に考えると「ユビキチン化システムを阻害するとサリチル酸作用が強くなる」ということになる。ユビキチン化システムはきわめて多くの過程に関わっているのでそんなに単純に考えてよいのかという問題がある。何らかの因子に対する選択性があればサリチル酸に効きやすくなることもあるかもしれない。
MAP kinase phosphatase1 and protein tyrosine phosphatase1 are repressors of salicylic acid synthesis and SNC1-mediated responses in Arabidopsis Sebastian Bartels など PMID: 19789277 PMCID: PMC2768924
GSH 生合成変異体 (rml1)、阻害剤 (BSO) で PR-1 の発現は増加しないらしい。 Low glutathione regulates gene expression and the redox potentials of the nucleus and cytosol in Arabidopsis thaliana. Schnaubelt D, Queval G, Dong Y, Diaz-Vivancos P, Makgopa ME, Howell G, De Simone A, Bai J, Hannah MA, Foyer CH. Plant Cell Environ. 2015 Feb;38(2):266-79. doi: 10.1111/pce.12252. Epub 2014 Jan 13. PMID: 24329757
pad2-1 (phytoalexin deficient 2-1) という変異体は GSH1 遺伝子の機能が低下してグルタチオン量が減少している。いくつかの論文に出てくる。
Plant Signal Behav. 2012 Feb;7(2):210-2. doi: 10.4161/psb.18831. Epub 2012 Feb 1. Role of glutathione in plant signaling under biotic stress Carole Dubreuil-Mauriziなど PMID: 22353869 PMCID: PMC3405692 pad2-1 変異体では活性酸素ストレスに強く応答する遺伝子が発現誘導される。サリチル酸応答性遺伝子はかえって反応しなくなる。
Front Plant Sci. 2017 Aug 28;8:1464. doi: 10.3389/fpls.2017.01464. eCollection 2017. Effects of Combined Low Glutathione with Mild Oxidative and Low Phosphorus Stress on the Metabolism of Arabidopsis thaliana Atsushi Fukushima など PMID: 28894456 PMCID: PMC5581396 グルタチオン量と軽い酸化ストレス（methyl viologen）とリン欠乏という異なる種類のストレスの相互作用を調べている。アントシアニン、グルコシノレートなどの二次代謝産物にも大きな変化がある。 GSE57286 というアレイデータが公開されている。pad2 では PR-1 の発現量は全く高まっていない。
Potentiation of pathogen-specific defense mechanisms in Arabidopsis by beta -aminobutyric acid Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7;97(23):12920-5. doi: 10.1073/pnas.230416897. L Zimmerli 1 , G Jakab, J P Metraux, B Mauch-Mani PMID: 11058166 PMCID: PMC18865
Fig. 2 に PR-1 の発現量を見たデータがある。BABA 単独ではほとんど増加していない。しかし菌感染時に BABA が存在するとすばやく、強く増加するというプライミング作用を示している。
BABA-induced pathogen resistance: a multi-omics analysis of the tomato response reveals a hyper-receptive status involving ethylene. Zapletalová M など Hortic Res. 2023 Apr 13;10(6):uhad068. doi: 10.1093/hr/uhad068. eCollection 2023 Jun. PMID: 37287445
トマトを実験材料にしている。Abstract に「 Surprisingly, salicylic acid (SA) is not involved in BABA downstream signalization whereas ET and JA play a crucial role.」と書かれている。
BABA に関する発現データを https://www.omicsdi.org/ OmicsDI で検索すると、GSE16434, GSE9515, GSE4203, E-MTAB-8720 があった。
A Novel Guanine Elicitor Stimulates Immunity in Arabidopsis and Rice by Ethylene and Jasmonic Acid Signaling Pathways. Wang L, Liu H, Yin Z, Li Y, Lu C, Wang Q, Ding X. Front Plant Sci. 2022 Feb 17;13:841228. doi: 10.3389/fpls.2022.841228. eCollection 2022. PMID: 35251109
植物の免疫力を強化する菌抽出液 ZNC の主成分がグアニンであることを明らかにした。これはエチレンとジャスモン酸の作用を活性化していてサリチル酸のシグナルには依存していない。
Insight into mechanisms of multiple stresses tolerance in a halophyte Aster tripolium subjected to salinity and heavy metal stress. Wiszniewska A, Koźmińska A, Hanus-Fajerska E, Dziurka M, Dziurka K. Ecotoxicol Environ Saf. 2019 May 3;180:12-22. doi: 10.1016/j.ecoenv.2019.04.059. PMID: 31059903
この論文は重金属ストレスのところで出てきたが、塩ストレスの効果も調べている。重金属ストレスとは異なり、塩ストレスではサリチル酸の量は増加しない。
Plant and Soil May 2012, Volume 354, Issue 1–2, pp 81–95 Salicylic acid-altering Arabidopsis mutants response to salt stress
200mM NaCl 24 時間処理で SA の蓄積量は 1.5 倍に一応増えているが、差は小さい。
「塩類ストレス条件下のイネにおける. サリチル酸の蓄積とストレス傷害への関与.」 筑波大学大学院、澤田博士の学位論文 では、イネを3日間塩ストレス処理した際のサリチル酸の蓄積量を調べている。塩ストレスによって、遊離型のサリチル酸の蓄積量が 1 日後には2倍になっている。その後差は小さくなる。結合型サリチル酸の蓄積量は差が小さい。
もっと長時間塩ストレス下で育成した場合はどうか。 Lack of salicylic acid in Arabidopsis protects plants against moderate salt stress. Cao Y, Zhang ZW, Xue LW, Du JB, Shang J, Xu F, Yuan S, Lin HH. Z Naturforsch C. 2009 Mar-Apr;64(3-4):231-8. PMID: 19526718 という論文がある。サリチル酸の量は測定されていないが、サリチル酸の蓄積量を減らす NahG 遺伝子を導入した植物はマイルドな塩ストレス培地で生育（15日間育成した）が改善されている。NahG 遺伝子はサリチル酸をカテコールにする。カテコールの影響も考えられる。他のサリチル酸関連遺伝子変異体も調べればよいはずだがデータはない。
NLR locus-mediated trade-off between abiotic and biotic stress adaptation in Arabidopsis. Ariga H, Katori T, Tsuchimatsu T, Hirase T, Tajima Y, Parker JE, Alcázar R, Koornneef M, Hoekenga O, Lipka AE, Gore MA, Sakakibara H, Kojima M, Kobayashi Y, Iuchi S, Kobayashi M, Shinozaki K, Sakata Y, Hayashi T, Saijo Y, Taji T. Nat Plants. 2017 May 26;3:17072. doi: 10.1038/nplants.2017.72. PMID: 28548656 では、やや弱い塩ストレスを長時間与える（馴化処理）ことで塩、浸透圧ストレス時に SA 応答、また SA と関係ない病原菌感染応答が起きて、それらがかえって有害に働き芽生えは枯れやすくなることを示している。この応答は系統間の違いが大きいことを利用して、 ACQOS 遺伝子が発見された。これは Disease resistance protein (TIR-NBS-LRR class) と注釈されている。ACQOS は Col では強く働いているが Bu-5, Bur-0 では働いていない。
Autophagy contributes to regulation of the hypoxia response during submergence in Arabidopsis thaliana. Chen L, Liao B, Qi H, Xie LJ, Huang L, Tan WJ, Zhai N, Yuan LB, Zhou Y, Yu LJ, Chen QF, Shu W, Xiao S. Autophagy. 2015;11(12):2233-46. doi: 10.1080/15548627.2015.1112483. PMID: 26566261 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4835207/
Fig. 7A にサリチル酸の蓄積量のデータがある。処理前では、atg5-1 変異体は野生型の約 2 倍に増加している。Submergence 水に浸すと一時的にサリチル酸の量は少し減少し、12 時間後には元の量と同じ程度に回復している。これは野生型でも atg 変異体でも同じ傾向を示している。
Increasing the resilience of plant immunity to a warming climate Nature. 2022 Jun 29. doi: 10.1038/s41586-022-04902-y. Online ahead of print. Jong Hum Kim など PMID: 35768511
この論文では、まず 23 ℃でシロイヌナズナを4週間育成している。28 ℃または 22 ℃で 2 日間 (Heat wave と対照)さらに育成する。28 ℃では病原細菌（Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000）に対する抵抗性が減少する。 ICS1 の mRNA 量が減少してサリチル酸の蓄積量が減少する。細菌が感染していない場合は半分くらいになり（小さい変化）、細菌が感染した場合 22℃ではサリチル酸の蓄積量が大きく増加するが 28 ℃ではあまり増加しない。穏やかな高温だけではあまり変化がないが、細菌が感染した際には応答が大きく抑えられている。
以前から PHYB, ELF3 という因子が温度センサーとして働いているということがわかっていた。しかしそれらはサリチル酸、細菌感染に対する応答とは関係なかった。
ICS1 を常に強く発現させても、28℃でのサリチル酸蓄積量の減少は打ち消されなかった。
サリチル酸作用にとても重要な NPR1 は、 npr1 S11D/S15D というアミノ酸置換によってリン酸化された状態を模倣して常に活性化する。それを導入した NPR1 活性化植物でも、23℃では細菌感染に応答してサリチル酸の蓄積量が大きく増大したが 28℃ではほとんどサリチル酸が増加しない(Fig.1e)。このときこのリストの上の方にも出てきた CBP60g の発現量も同じように変動している。SARD1 も重要な役割を果たしている。
CBP60g 遺伝子を常に活性化した植物では、28℃でも細菌感染に対する応答が強く起きるようになった (Fig.3a)。
「Optimization of growth versus defence」 成長と免疫応答は、同時に両方を十分に促進することは難しいトレードオフの関係にある。CBP60g を強く発現させて高温での免疫応答を回復させた場合に成長はどうなるかを調べたところ、ほとんど成長に影響はなかった。このことは実用作物への応用に役立つ。
温度を感知する仕組みとして、GDAC (GBPL defence-activated condensates) と呼ばれる、相分離によって生じる凝集体が働いている。
A phase-separated nuclear GBPL circuit controls immunity in plants Nature. 2021 Jun;594(7863):424-429. doi: 10.1038/s41586-021-03572-6. Epub 2021 May 26. Shuai Huang など PMID: 34040255 PMCID: PMC8478157
ポリエチレングリコールの水溶液をオートクレーブすると二層に分離して、室温に戻ると元に戻る。塩濃度やポリマーの種類を変えると室温でも相分離が起きて、水性二相分配法と呼ばれる。オルガネラの単離に使われることがある。それと同じことが核の内部で起きて、凝集体には GBPL3 (At5g46070, GBPL1 は At1g03830, GBPL2 は At2g38840)、Mediator (転写補助因子)、RNA PolII が集合している。それが CBP60G の転写を活性化する。 ポリエチレングリコールの水溶液と同様に、GDAC も温度感受性が高く、室温と 28℃で凝集の仕方が変化する。それによって温度が感知される。
Abscisic acid deficiency antagonizes high-temperature inhibition of disease resistance through enhancing nuclear accumulation of resistance proteins SNC1 and RPS4 in Arabidopsis. Mang HG, Qian W, Zhu Y, Qian J, Kang HG, Klessig DF, Hua J. Plant Cell. 2012 Mar;24(3):1271-84. doi: 10.1105/tpc.112.096198. Epub 2012 Mar 27. PMID: 22454454
シロイヌナズナは普通22度程度で育成する。snc1 という変異体はサリチル酸の蓄積量が野生型の二倍多い (Fig. 7A) が、28度で育成すると野生型と同じ量に低下する。aba2 変異体でも同じ傾向を示している。この論文では、野生型は22度、28度でサリチル酸の蓄積量に変化がない。
温度は生物に多大な影響を与える。呼吸量はそのよい例である。 シロイヌナズナで温度が与える影響を詳細に調べた論文があった。
Ambient temperature and genotype differentially affect developmental and phenotypic plasticity in Arabidopsis thaliana. Ibañez C, Poeschl Y, Peterson T, Bellstädt J, Denk K, Gogol-Döring A, Quint M, Delker C. BMC Plant Biol. 2017 Jul 6;17(1):114. doi: 10.1186/s12870-017-1068-5. PMID: 28683779
上に書いたように、低温に馴化したシロイヌナズナはサリチル酸の蓄積量が増大する。28度で減少しやすいということはそのことの逆と関連があるのかもしれない。
Metabolic and physiological analyses reveal that Populus cathayana males adopt an energy saving strategy to cope with phosphorus deficiency. Zhang S, Tang D, Korpelainen H, Li C. Tree Physiol. 2019 Jun 25. pii: tpz074. doi: 10.1093/treephys/tpz074. [Epub ahead of print] PMID: 31237332
ポプラを実験に用いている。「Salicylic acid significantly decreased under Pi deficiency in male leaves and female roots. 」と書かれている。他の植物や組織ではどうなのだろうか。窒素との違いはどこにあるのだろうか。リン欠乏ではアントシアニンが増えるはずだが、サリチル酸はなぜ増えないのだろうか。
リン欠乏ではエネルギーを節約するためにピロリン酸を用いた代謝が優先される。
ジャスモン酸は顕著に増えている。リン欠乏ではリン脂質からリンが取れた状態になりやすく、遊離した脂質からジャスモン酸ができるのかもしれない。
Organ–specific hormonal cross-talk in phosphate deficiency Environmental and Experimental Botany Volume 153, September 2018, Pages 198-208 https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2018.05.020
Fig. 3 に各種のホルモンを同時測定した結果がヒートマップで表現されている。葉ではジャスモン酸がリン欠乏で増加する。葉ではサリチル酸は増加していない。 しかし根ではリン欠乏でサリチル酸の量が増加する。
ジャスモン酸が増えるとサリチル酸は増えにくくなるという関係があるらしい。ジャスモン酸の作用に重要な転写因子 MYC2 がサリチル酸の生合成に影響を与えるという論文があった。
MYC2 influences salicylic acid biosynthesis and defense against bacterial pathogens in Arabidopsis thaliana. Gautam JK, Giri MK, Singh D, Chattopadhyay S, Nandi AK. Physiol Plant. 2021 Oct 1. doi: 10.1111/ppl.13575. PMID: 34596247
HPLC で測定することができる。サリチル酸は蛍光を発するので、蛍光検出器で測定できる。サリチル酸は 300 nm 付近に吸収のピークがあるが、あまり強くないので植物に含まれる SA を吸収で測定することはできない。蛍光は励起波長が 313 nm, 蛍光波長が 405 nm という例がある。
「塩類ストレス条件下のイネにおける. サリチル酸の蓄積とストレス傷害への関与.」 筑波大学大学院、澤田博士の学位論文
内部標準として o-アニス酸を使うことができる。アニス酸はサリチル酸と同じ条件で蛍光検出できる。HPLC でかなり離れた位置に溶出する。しかし o-アニス酸と同じ位置で溶出し、蛍光を発する化合物が植物抽出物に存在することもある。
Ortho-anisic acid as internal standard for the simultaneous quantitation of salicylic acid and its putative biosynthetic precursors in cucumber leaves. Meuwly P, Métraux JP. Anal Biochem. 1993 Nov 1;214(2):500-5. PMID: 8109740
Marques TL, Moraes LMB, Rocha FRP. Systematic evaluation of sample preparation for fractionation of phytohormone salicylic acid in fresh leaves. Talanta. 2020;208:120352. doi:10.1016/j.talanta.2019.120352
サリチル酸について書かれた文書に「サリチル酸は 50 ℃以上で揮発性が顕著になる」と記載されている。
「国際化学物質安全性カード サリチル酸 ICSC番号:0563」 http://www.nihs.go.jp/ICSC/icssj-c/icss0563c.html
植物に含まれるサリチル酸を抽出定量する際にもそのことに気をつけないといけない。とくに酸性にして酢酸エチルで抽出した後に乾燥しすぎるとよくないらしい。それに関する論文もある。
Method for the extraction of the volatile compound salicylic acid from tobacco leaf material. Verberne MC, Brouwer N, Delbianco F, Linthorst HJ, Bol JF, Verpoorte R. Phytochem Anal. 2002 Jan-Feb;13(1):45-50. PMID: 11899606
とても興味深い論文があった。 In vivo detection of salicylic acid in sunflower seedlings under salt stress https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2018/ra/c8ra03475c Y Hu 著 - ‎2018 - サリチル酸は電気化学的にも興味深い性質を示す。ひまわりの茎に小さな穴を二つ開けて、それぞれに電極をセットする。電気化学的にサリチル酸に特異的なピークを検出することができる。生きた植物を用い時系列で連続的にサリチル酸量の測定をすることができる。 他にも電気化学的な方法があり introduction で紹介されている。
Disposable stainless steel working electrodes for sensitive and simultaneous detection of indole-3-acetic acid and salicylic acid in Arabidopsis thaliana leaves under biotic stresses Anal Bioanal Chem. 2022 Sep 7. doi: 10.1007/s00216-022-04303-0. Online ahead of print. Ling Sun など PMID: 36068347
電極を自作して小さく打ち抜いた（Harris Uni-Core Sampling Tool というパンチを使っている）葉をのせ、緩衝液をかけて濾紙で挟み込む。Differential pulse voltammetry (DPV) という方法で検出する。専用の測定装置がある。
Development of a structure-switching aptamer-based nanosensor for salicylic acid detection. Chen C, Feng S, Zhou M, Ji C, Que L, Wang W. Biosens Bioelectron. 2019 May 24;140:111342. doi: 10.1016/j.bios.2019.111342. [Epub ahead of print] PMID: 31153018
Abstract に「This nanosensor also exhibited good selectivity among SA and its common metabolites and can detect SA in Arabidopsis and rice using only about 1 μl plant extracts within less than 30 min. 」と書かれている。
Highly Selective and Sensitive Detection of a Biogenic Defence Phytohormone Salicylic Acid in Living Cells and Plant Using a Novel and Viable Rhodamine-Functionalised Fluorescent Probe. J Agric Food Chem. 2020 Mar 31. doi: 10.1021/acs.jafc.9b06771. PMID: 32227949
Determination of four salicylic acids in aloe by in vivo solid phase microextraction coupling with liquid chromatography-photodiode array detection. Fang X, Chen G, Qiu J, Xu J, Wang J, Zhu F, Ouyang G. Talanta. 2018 Jul 1;184:520-526. doi: 10.1016/j.talanta.2018.03.043. Epub 2018 Mar 15. PMID: 29674078
組織から効率よく標的分子を抽出することはとても大切なことである。標的分子が限定されているなら、それらの分子が選択的に抽出される方法を見つけることで分析が楽になる。この論文では、独自のコーティングをマイクロファイバーに施した。アロエの葉（厚い）に細いチューブに仕込んだマイクロファイバーを刺して組織液に含まれるサリチル酸を抽出した。取り出してメタノールで溶出して HPLC で分析した。
サリチル酸生合成経路は複数存在する。BA (Benzoic acid) からのサリチル酸合成は、シロイヌナズナではマイナーな経路だが少しは働いていると言われている。 BA からの経路の方が主要である植物種も存在する。
Benzoic acid 2-hydroxylase, a soluble oxygenase from tobacco, catalyzes salicylic acid biosynthesis. León J, Shulaev V, Yalpani N, Lawton MA, Raskin I. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Oct 24;92(22):10413-7. PMID: 7479795
タバコを材料にして、Banzoic acid を水酸化しサリチル酸に変換する反応を触媒する酵素 BA-2-hydroxylase (BA2H) を精製したと記載されている。この酵素は可溶性の Cytochrome P450 という珍しい酵素であると書かれている。
どうしたことか、2019 年になってもこの酵素をコードする遺伝子を同定したという報告はない。
The Peroxisomal β-Oxidative Pathway and Benzyl Alcohol O-Benzoyltransferase HSR201 Cooperatively Contribute to the Biosynthesis of Salicylic Acid Yu Kotera, Hirotomo Komori, Kosuke Tasaki, Kumiko Takagi, Sayaka Imano, Shinpei Katou Plant and Cell Physiology, Volume 64, Issue 7, July 2023, Pages 758–770, https://doi.org/10.1093/pcp/pcad034
タバコでのサリチル酸生合成に関するすばらしい成果が発表された。
Reactions of hydroxyl radicals with benzoic acid and benzoate pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2017/ra/c7ra05488b
安息香酸はヒドロキシラジカルと反応する。反応によってサリチル酸が生成する可能性がある。量子化学計算によって反応定数などを計算できている。こういう仕組みが細胞内で働くかもしれない。
BAH1/NLA, a RING-type ubiquitin E3 ligase, regulates the accumulation of salicylic acid and immune responses to Pseudomonas syringae DC3000. Yaeno T, Iba K. Plant Physiol. 2008 Oct;148(2):1032-41. doi: 10.1104/pp.108.124529. Epub 2008 Aug 27. PMID: 18753285
bah1-D という変異体は benzoic acid hypersensitive1-Dominant の略で、安息香酸 Benzoic acid (BA) に対する感受性が高い。 野生型は BA を与えても生育はほとんど抑制されずサリチル酸の蓄積量は増大しない。一方 bah1-D は BA を与えると生育が強く押さえられサリチル酸の蓄積量は約 2 倍に増加する。
この変異体をピートモスだけ（窒素源が少ない）の培地で育成するとサリチル酸の量が増加するが、硝酸イオンを与えると減少する。このとき安息香酸 Benzoic acid (BA) の量も並行して変化する。BA2H については Discussion で少し触れられている。
BAH1 遺伝子は、NLA (Nitrogen Limitation Adaptation) という名前でも知られている。
A mutation in NLA, which encodes a RING-type ubiquitin ligase, disrupts the adaptability of Arabidopsis to nitrogen limitation. Peng M, Hannam C, Gu H, Bi YM, Rothstein SJ. Plant J. 2007 Apr;50(2):320-37. Epub 2007 Mar 12. PMID: 17355433
nla 変異体は、窒素源が欠乏すると葉がすぐに黄色くなる（セネッセンス）という表現型を示す。上に書いたように、葉がセネッセンスする際にはサリチル酸が増加するという報告がある。Peng らの論文ではサリチル酸については全く実験、考察されていない。BAH1 の結果と合わせると、早いセネッセンスの原因はサリチル酸の蓄積量の増加によると推測することもできる。 また、活性酸素 ROS の処理に重要な役割を果たしているグルタチオン GSH は窒素を多く含む化合物である。窒素源が欠乏すると GSH が欠乏し、活性酸素を消去しきれなくなって活性酸素ストレスがかかる。nla / bah1 では活性酸素ストレスが強くなって早くセネッセンスすることも考えられる。
NLA 遺伝子に関する研究が進んでいる。
Nitrogen limitation adaptation, a target of microRNA827, mediates degradation of plasma membrane-localized phosphate transporters to maintain phosphate homeostasis in Arabidopsis. Lin WY, Huang TK, Chiou TJ. Plant Cell. 2013 Oct;25(10):4061-74. doi: 10.1105/tpc.113.116012. Epub 2013 Oct 11. PMID: 24122828
NITROGEN LIMITATION ADAPTATION recruits PHOSPHATE2 to target the phosphate transporter PT2 for degradation during the regulation of Arabidopsis phosphate homeostasis. Park BS, Seo JS, Chua NH. Plant Cell. 2014 Jan;26(1):454-64. doi: 10.1105/tpc.113.120311. Epub 2014 Jan 28. PMID: 24474629
Arabidopsis NITROGEN LIMITATION ADAPTATION regulates ORE1 homeostasis during senescence induced by nitrogen deficiency. Park BS, Yao T, Seo JS, Wong ECC, Mitsuda N, Huang CH, Chua NH. Nat Plants. 2018 Nov;4(11):898-903. doi: 10.1038/s41477-018-0269-8. Epub 2018 Oct 29. PMID: 30374089
Nitrogen Limitation Adaptation (NLA) is involved in source-to-sink remobilization of nitrate by mediating the degradation of NRT1.7 in Arabidopsis. Liu W, Sun Q, Wang K, Du Q, Li WX. New Phytol. 2017 Apr;214(2):734-744. doi: 10.1111/nph.14396. Epub 2016 Dec 29. PMID: 28032637
PHOSPHATE TRANSPORTER1 (PHT1、根で外部からリンを取り込む) の分解、硝酸イオンの輸送体 NRT1.7 の分解に NLA が関与している。NLA が働かなくなると根の細胞にリンが蓄積しやすくなる。また窒素の再配分ができにくくなる。
NLA は細胞表面に存在するリン酸、硝酸トランスポーター以外の重要な分子の分解、安定性にも影響を与え、それがサリチル酸などの蓄積量に影響を与えることもあり得ると考察されている。
Benzoic acid は植物が生合成する化合物であり、細胞内にかなりの量が含まれる。 SA の前駆体としての働きだけでなく、他種の植物の成長に影響を与えるアレロケミカル Allelochemical として研究されている。
Evidences for the Involvement of Auxin, Ethylene and ROS Signaling during Allelochemical Benzoic Acid-Mediated Primary Root Inhibition of Arabidopsis. Zhang W, Lu LY, Hu LY, Cao W, Sun K, Sun QB, Siddikee MA, Shi RH, Dai CC. Plant Cell Physiol. 2018 Jun 8. doi: 10.1093/pcp/pcy107. PMID: 29893960 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29893960
BA がシロイヌナズナの根においてインドール酢酸の生合成を促進するという興味深い結果が示されている。
Immune activation during Pseudomonas infection causes local cell wall remodeling and alters AGP accumulation Sang-Jin Kim, Deepak D. Bhandari, Rylee Sokoloski, Federica Brandizzi Plant J. Version of Record online: 26 July 2023
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