2014分子生物学会

2014年度分子生物学会第３７会年会発表要旨

【3P-0274】

非コードRNA CCDC26がc-Kitの転写調節を介して骨髄性白血病細胞の増殖を制御している

平野哲男(1)、吉川量子(1)、原田浩徳(2)、原田結花(2)、石田敦彦(1)、山崎岳(1)

1広島大学大学院総合科学研究科生命科学研究領域、 2順天堂大学医学部血液内科

CCDC26は小児急性骨髄性白血病 (AML) の患者群中，小規模コピー数変動の見られる遺伝子のトップにランクされるため、疾患との関わりが示唆されている。その転写物にコードされる仮想上のタンパク質（107a.a.）は保存性がなく、既知のタンパク質との相同性も見られないため、機能性非コードRNAと思われるが、詳細は不明である。

方法と結果：CCDC26転写物はヒト骨髄性白血病細胞株K562細胞の核分画で多く見られた。機能を調べるため、shRNAを用いて遺伝子ノックダウン (KD)を行った。単離した約200クローンのG418耐性株のうち、4クローンで発現レベルが1%以下まで抑えられていた。この4クローンは、前駆体RNAのイントロン部分も転写量が低下しており、通常のRNA干渉による転写後抑制ではなく、遺伝子転写抑制 (TGS)が起こっていることが示唆された。CCDC26の2種類のsplicing variantの一方のみを標的とするshRNAによるKDクローンで他方の転写量が同じ様に抑制されていることもTGSを支持する。KDクローンはいずれも対象細胞に比べ15%血清存在下での増殖率の低下が観察され、逆に、血清非存在下では、増殖傾向と血清除去後の生き残り期間の延長が見られた。すべてのKDクローンで発現変動がある遺伝子をDNAマイクロアレイ、qRT-PCRによりスクリーニングしたところ、チロシンキナーゼ受容体c-Kit に顕著な発現上昇が見いだされた。c-KitはAMLにおいて活性更新変異が見られる遺伝子のひとつである。c-Kit特異的阻害剤ISCK03でKDクローンを処理したところ、KDクローンの血清非存在下における生存期間の延長は解消された

結論：本研究では、骨髄性白血病細胞においてCCDC26がc-Kitの発現調節を介して細胞増殖制御を行っていることが示唆された。この知見からCCDC26の変異を持つ小児AMLに対し、c-Kit阻害剤が有効となる可能性がある。

Tetsuo Hirano, Ryoko Yoshikawa, Hironori Harada, Yuka Harada, Atsuhiko Ishida, Takeshi Yamazaki

Non-coding RNA CCDC26 controls growth of myeloid leukemia cells through regulation of c-Kit expression

(Domain of Life Sciences, Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University, Department of Hematology, Juntendo University School of Medicine)

CCDC26 is related to childhood acute myeloid leukemia (AML), since it is highly ranked in genes with copy number alteration in patients of the disease. As a short hypothetical protein encoded in CCDC26 has no homology with known proteins, it is considered as a non-coding RNA, whatever its actual function is. Methods and Results: CCDC26 transcript was abundant in the nuclear fraction of K562 human myeloid leukemia cells. To examine the function of CCDC26, gene knockdown (KD) was performed using shRNAs. Four clones in which expression of the gene suppressed to 1% or less are isolated. Transcriptional gene suppression (TGS), not post-transcriptional seems to occur, since the suppression is also observed in the intron of its precursor RNA. The result that the shRNA targeted to one of the two CCDC26 splicing variants suppressed the other supports TGS. Growth rates of KD clones were reduced compared to control cells in the presence of serum. On the contrary, enhanced growth rates in the absence of serum and extension of survival period after serum withdrawal were observed. Screening with DNA microarray and qRT-PCR for genes whose expression varies between KD clones and control cells revealed a significant increase of the tyrosine kinase receptor c-Kit, whose hyperactive mutations is often found in AML. Treatment of the KD clones with c-Kit inhibitor ISCK03 eliminated the extension of survival of KD clones in the absence of serum. Conclusion: In this study, it is suggested CCDC26 controls growth of myeloid leukemia cells through regulation of expression of c-Kit. Treatment with c-Kit inhibitor might be effective treatment against childhood AML with alteration of the CCDC26 gene.

【3P-0273】

急性骨髄性白血病に関係するCCDC26のマウスホモログ同定と発現解析

吉川量子(1)、原田浩徳(2)、原田結花(2)、石田敦彦(1)、山崎岳(1)、平野哲男(1)

1広島大学大学院総合科学研究科生命科学グループ、 2順天堂大学医学部血液内科

CCDC26はヒト小児急性骨髄性白血病でコピー数変異の見られる遺伝子のトップにあげられ、HL-60（急性骨髄性白血病細胞株）のDMSOによる分化誘導でその発現が停止することから、急性骨髄性白血病との関連が示唆されている。CCDC26は短いオープンリーディングフレームはあるものの既知のタンパク質との相同性は見られず、保存性もないので、RNA自体が長鎖非コードRNA (lncRNA)として機能していると考えられる。生理機能の解析にはノックアウトマウスが有用であるが、CCDC26マウスホモログは発見されていないので、その同定を試みた。ヒト-マウス間シンテニー解析によってCCDC26と相同性の高いマウスのゲノム領域を特定し、MEL（マウス赤白血病細胞株）で発現の見られたmCcdc26とAK015428をヒトCCDC26関連転写産物マウスホモログ候補とし、その発現動態を解析した。血球系由来の培養細胞株とマウス各組織でのmCcdc26、AK015428の発現を定量RT-PCRを用いて解析すると、骨髄性細胞のM1（マウス骨髄芽球細胞）と骨髄での発現が見られ、ヒトCCDC26の発現パターンとよく似ていた。予想外なことにmCcdc26は胸腺と精巣で、AK015428は精巣での発現が非常に高かった。次に、DMSOによるMEL（マウス赤白血病細胞）の赤芽球様細胞への分化に伴うmCcdc26、AK015428の発現動態を定量RT-PCRを用いて解析した。分化誘導後、両遺伝子は分化に先立って早期に著しく減少した。このこともDMSOによるHL-60の分化に伴うヒトCCDC26の発現停止とよく似ている。さらに、精巣、胸腺とMELから抽出したRNAを用いてノザンブロッティングを行ったところ、mCcdc26は精巣、胸腺、MELで両方向の発現が見られ、一方AK015428では片側方向のみ発現していたが精巣とMELでは互いに逆方向であった。また、マウス精巣でin situ ハイブリダイゼーションを行い、AK015428の局在を解析したところ精細管内での発現が見られ、精子形成になんらかの機能を持つ可能性が示唆された。結論：CCDC26と同様の発現動態が得られたことから、mCcdc26とAK015428はCCDC26マウスホモログである可能性が高い。また、両遺伝子はMELの分化や精子形成に機能をもつlncRNAであるかもしれない。

Identification and expression analysis of CCDC26 mouse homologs correlates with acute myeloid leukemia.

Ryoko Yoshikawa, Hironori Harada, Yuka Harada, Atsuhiko Ishida, Takeshi Yamazaki, Tetsuo Hirano,

(Domain of Life Sciences, Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University, Department of Hematology, Juntendo University School of Medicine)

CCDC26 is suggested to correlate with acute myeloid leukemia (AML) as it is ranked in the top of the genes whose copy number changes in childhood AML patients and it is repressed during DMSO-induced differentiation of HL-60 (human AML cells). CCDC26 encodes a short open reading frame with no homology to known proteins and is thought to be a long non-coding RNA. CCDC26 knockout mice would be useful for the analysis of its physiological function, however, its mouse homolog is still unknown. We determined two transcripts, mCcdc26 and Ak015428 in MEL (murine erythroleukemia cells) within the syntenic region of human CCDC26 loci.The expression of both mCcdc26 and AK015428 in M1 (mouse myeloid cells) among hematopoietic-derived cell lines and in mouse bone marrow revealed with qRT-PCR resembled myeloid specific expression of human CCDC26. Unexpectedly, significantly high expression of AK015428 in testis and of mCcdc26 in thymus and testis was observed. Analysis of expression of both genes during DMSO-induced differentiation of MEL by qRT-PCR showed remarkable reduction of them early before differentiation, just like CCDC26in HL-60. Moreover, northern blot analysis revealed expression of mCcdc26 in both direction in testis, thymus and MEL, and of AK015428 in one but opposite direction each other in testis and MEL. In situ hybridization analysis of mouse testis revealed the expression of AK015428 in seminiferous tubules. As a conclusion, from resemblance of the expression pattern of mCcdc26 and AK015428 to those of human CCDC26, they are likely to be mouse homologs of CCDC26 that have roles in differentiation of MEL and spermatogenesis.