デジタル画像のスペクトル変換を用いた環境水中の亜硝酸態窒素(N-NO₂)と化学的酸素要求量(COD)の測定¹⁾

Abstract

              Using a technique of visible spectrum simulation from digital color image of test solution colored by an analytical regent as a substitute of spectrophotometer, it was examined to introduce spectrophotometric method into student’s activities on the environmental water analysis. As exemplified by the determinations of nitrite nitrogen (N-NO₂) and chemical oxygen demand (COD) in the environmental water, the details of the experimental procedures were investigated by referring the typical results of analyses. As the results, it was indicated that by simulating the visible spectra from the RGB values of colored test solutions the N-NO₂ and COD in the environmental water can be determined quantitatively by the spectrophotometric methods.

Keywords: Environmental water analysis, nitrate nitrogen, chemical oxygen demand, digital color image, spectrum conversion

２　実　験　方　法

2.1 亜硝酸イオンの検量線

　三角フラスコに種々の濃度（0〜2 mg NO₂^- L^-1）の亜硝酸ナトリウム水溶液を10 mLずつ分取した。それぞれにザルツマン試薬²¹⁾5 mLを加え，撹拌後5分間静置して検液とした。検液を光路長10 mmのポリスチレン製のセルに入れ，分光法と変換法の2通りの方法で可視吸収スペクトルを得た。

(1) 分光法：蒸留水を参照溶液とし，紫外可視分光光度計(Shimadzu UVmini-1240)を用いて検液の可視吸収スペクトル(400〜700nm)を測定した。

(2) 変換法¹¹⁾：発泡スチロール板で製作したサンプルホルダーに検液を入れたセルをはめ込み，汎用フラットヘッドスキャナ(EPSON GT-8700F)を用いて，検液のデジタル画像を得た。画像解析ソフト(KAnalyst フリーウェア)により，各検液のデジタル画像からRGB各値の平均値を取得し，既報の方法¹¹⁾により可視吸収スペクトル(400〜700nm)をシミュレーションした。

　分光法および変換法により得た可視吸収スペクトルの極大吸収波長における吸光度を用いて，濃度決定のための検量線を作成した。

2.2　CODの検量線

　100 mLのメスフラスコに種々の濃度（COD 0〜100 mgO L^-1）のグルコース水溶液を5 mLずつ分取した。それぞれのメスフラスコに2 mol L^-1水酸化ナトリウム水溶液1 mLを加え，さらに4×10^-3 mol L^-1過マンガン酸カリウム水溶液5 mLを加えた。3分後に蒸留水で100 mLに希釈し，検量線作成のための検液とした。それぞれの検液をポリスチレン製セル（光路長10 mm）に入れ， 2.1と同様に分光法および変換法により得た可視吸収スペクトルを基にして，検量線を作成した。

2.3 水質分析

　水道水，河川水，緑茶，味噌汁，および清涼飲料水を検液として，上述した方法により亜硝酸イオン濃度とCODを測定した。JIS法²²⁾およびパックテストによる分析結果と比較して，本報の分析法の信頼性と教材的手法としての有用性を議論した。

３　結　果　と　考　察

3.1 亜硝酸イオンの検量線

　図１に，種々の濃度の亜硝酸イオン標準溶液とザルツマン試薬の反応による呈色液の可視吸収スペクトルを示す。吸収スペクトルは，いずれの亜硝酸イオン濃度においても543nm付近で極大吸収を示し，亜硝酸イオン濃度の増加に伴い極大吸収波長における吸光度が単調に増加する。これは，亜硝酸イオン濃度に依存した呈色変化が，単一色(l_max=543nm)の色濃度変化であることを示している。図２に，亜硝酸イオン濃度と呈色液のデジタル画像のRGB値の関係を示す。亜硝酸イオン濃度の増加に伴い，G値の減少が見られる。一方，R値およびB値の変化は非常に小さい。これは，亜硝酸イオンとザルツマン試薬の反応による呈色が，RGB表色系におけるG値の基準スペクトルに近い波長で極大吸収を示す可視スペクトルの吸収によることを示している。

[Enlarged View]

図１　亜硝酸イオン標準溶液とザルツマン試薬による呈色液の可視吸収スペクトル(分光法)

[Enlarged View]

図２　亜硝酸イオン濃度に依存した呈色液のRGB値の変化

　図２に示した各亜硝酸イオン濃度における呈色液のRGB値を用いてスペクトル変換解析を行うと，図３に示すような可視吸収スペクトルが得られる。変換法によりシミュレーションしたスペクトルにおける吸光度の絶対値は，スキャナによる反射画像を用いたために図１の分光法による可視吸収スペクトルと大きく異なるが，極大吸収波長およびスペクトル形状はよく一致する。図４に，分光法および変換法により得た可視吸収スペクトルの極大吸収波長における吸光度と亜硝酸イオン濃度の関係を示す。JIS法では，図４の分光法のよる直線相関を検量線として用いるが，変換法により作成した検量線においても直線関係が見られる。

[Enlarged View]

図３　亜硝酸イオン標準溶液とザルツマン試薬による呈色液の可視吸収スペクトル(変換法)

[Enlarged View]

図４　亜硝酸イオン濃度と吸光度(l_max=543nm)の関係

3.2 CODの検量線

　図５に，種々の濃度のCOD標準溶液と一定量の過マンガン酸カリウム水溶液を塩基性条件下で反応させて得た検液の可視吸収スペクトルを示す。塩基性条件下では，赤紫色の過マンガン酸イオンMnO₄^-は，COD標準溶液との反応により黄緑色のマンガン酸イオンMnO₄^2-に還元される^23）。

                   MnO₄^-+ e→ MnO₄^2-                      (1)

このため，COD値の増加に伴いMnO₄^-による525nmおよび545nmに分裂した極大吸収波長の吸光度は減少し，MnO₄^2-による435nmおよび605nmにおける吸光度が増加する。図６に，図５のスペクトル測定に用いた検液のデジタル画像から得たRGB値のCOD値に依存した変化を示す。この場合，多色間の呈色変化であるためにR, GおよびB値のすべてにおいてCOD値に依存した変化が見られる。MnO₄^-による呈色は，G値の基準スペクトルに近い波長で極大吸収を示す可視スペクトルの吸収によるため，COD値の増加に伴いG値は増加する。一方，B値およびR値の基準スペクトルの極大吸収は，それぞれMnO₄^2-による吸収スペクトルの吸収極大波長である435nmおよび605nmに近接しているため，COD値の増加によるMnO₄^2-の生成量の増加に伴いB値およびR値が減少する。

[Enlarged View]

図５　塩基性条件下でのCOD標準溶液とKMnO₄水溶液による呈色液の可視吸収スペクトル(分光法)

[Enlarged View]

図６　COD値に依存した呈色液のRGB値の変化

　図７に，図６に示したRGB値を用いて変換法によりシミュレーションした検液の可視吸収スペクトルを示す。変換法により得られる吸収スペクトルは，R，G，Bおよびその混合色であるC，M，Yの基準スペクトルをRGB各値の大小関係により重み付けして足し合わせたものである^11,14)。このため，変換法によるMnO₄^-の吸収スペクトルでは，分光法で見られたピークの分裂を再現することはできない。しかしながら，変換法による吸収スペクトルの極大吸収波長535nmは，分光法による分裂した二つの極大吸収のちょうど中間に位置し，全体としてのスペクトルの形状も類似している。また，COD値が増加すると450nmより短波長側および600nmより長波長側の吸光度が増加し，還元生成したMnO₄^2-による吸収も再現している。

[Enlarged View]

図７　塩基性条件下でのCOD標準溶液とKMnO₄水溶液による呈色液の可視吸収スペクトル(変換法)

　図５および図７に示した吸収スペクトルのCOD値による変化をもとにしてCOD測定のための検量線を作成する場合，COD値0の吸収スペクトルを基準として，極大吸収波長における吸光度の減少量DAbsとCOD値との直線相関を用いることになる。図８に，分光法(l_max=525nm)および変換法(l_max=535nm)におけるCOD値とDAbsの関係を示す。いずれの方法により得られた検量線も良い直線性を示す。

[Enlarged View]

図８　COD値とDAbs(分光法:l_max=525nm, 変換法：l_max=535nm)の関係

3.3 RGB値を用いた検量線

　亜硝酸イオンの定量については，本報と同様にザルツマン試薬との反応により呈色した検液のデジタル画像からRGB値を読み取り，G値を反射率(あるいは透過率)として見立てることにより，次式から吸光度を求める方法が提案されている¹²⁾。

                   Abs = -log₁₀ (G / G₀)                                (2)

本報で用いた変換法による吸収スペクトルのシミュレーションにおいて，図２に示したようにG<B<Rの関係がある場合，波長lにおけるスペクトル強度I(l)は，リニアRGB値(0-1)を用いて次式で表わされる^{11, 14)}。

                   I(l) = G + (B-G)´MS(l) + (R-G)´RS(l)                  (3)

ここで, MS(l)およびRS(l)は，それぞれマゼンタM(=R+B)およびRの基準スペクトルのlにおける換算係数である。式(3)の関係と比較すると，式(2)の取り扱いは，lをGの基準スペクトルの極大吸収波長としたうえで，吸収スペクトルへのR値とB値の寄与を無視して式(3)の第1項のみを考慮した扱いとなる。上述したように，ザルツマン法による亜硝酸イオンの呈色液の極大吸収は，G値の基準スペクトルの極大吸収と非常に近い波長で観測される。また，亜硝酸イオン濃度に依存したR値およびB値の変化もほとんどないことから，式(2)による取り扱いは，式(3)の近似法としても妥当であると考えられる。

　図９(a)に，亜硝酸イオン濃度と図2のG値を用いて式(2)より求めた吸光度の関係を示す。図４に示した分光法および変換法により得た検量線に比べると回帰直線からの偏差が幾分大きくなるが，亜硝酸イオン濃度の範囲を小さくしたり，検液の希釈率を大きくしたりすることにより，直線性は改善できるものと思われる。式(2)と同様な取り扱いによる吸光光度法を，1-10-フェナントロリンを用いた鉄(II)イオンの定量分析¹⁰⁾および黄色食品着色料の濃度決定¹³⁾に応用した例が報告されている。いずれの場合も，亜硝酸イオンの場合と同様の解釈によりスペクトル変換解析の近似法としてその妥当性を評価することができる。

[Enlarged View]

図９　G値によるN-NO₂とCODの検量線

　一方，過マンガン酸カリウム塩基性法によるCOD測定の場合も,検液の極大吸収波長はG値の基準スペクトルの極大吸収に近い波長で観測されるが，COD値とともにR, G, およびB値のすべてが変化するために，変換法の近似としての式(2)による取り扱いには妥当性を欠く。比較のために，図６のG値を用いて式(2)より求めた吸光度差DAbsのCOD値に依存した変化を図９(b)に示す。この場合も，見かけ上は比較的良好な直線関係を示すが，図８に示した検量線と比較して，低濃度において回帰直線からの偏差が大きいことや検量線の傾きが小さくなることなど定量分析の結果に影響を及ぼすと考えられる違いが見られる。。

3.4 水質調査への応用

　表１に，上述した方法により得た身近な水溶液における亜硝酸態窒素とCODの分析値をJIS法およびパックテストによる結果と比較して示す²⁴⁾。亜硝酸態窒素においては，変換法およびG値を用いた近似法による分析値は，JIS法である分光法による結果とほぼ一致する結果が得られた。

　一方，CODにおいては，分光法および変換法による分析値は，清涼飲料水の場合を除いてJIS法の過マンガン酸カリウム酸性法（滴定法）と良い一致を示す。これに対して，G値を用いた近似法では，JIS法，分光法，および変換法の分析値からの偏差が大きいことがわかる。清涼飲料水に対するJIS法による分析値とその他の方法による結果の違いは，酸性法と塩基性法による違いによると考えられる²⁵⁾。

表1　種々の手法を用いて得た身近な水溶液中の亜硝酸態窒素とCODの分析結果

^*1 JIS法，^*2 KMnO₄酸性法(滴定法)，^*3 COD測定においては希釈溶液を用いた。希釈率(緑茶:´10^-2, 味噌汁: ´10^-3, 清涼飲料水: ´10^-3)

3.5 教材的手法としての有用性

　 前述した例のように，種々の水質調査項目に対する簡易測定法が，教材的手法として多数提案されている。学校現場における水質調査活動を含む学習においては，その目的や学習段階に応じて適切な簡易測定法を選択して学習指導計画を策定することができる。

　本報で紹介したデジタル画像のスペクトル変換を用いた手法では，試薬により呈色させた検液のデジタル画像からRGB値を読み取ることにより容易に呈色液の可視吸収スペクトルを描画することができる。また，分光光度計を用いた本来の吸光光度法と同様に，可視吸収スペクトルの極大吸収波長における吸光度を用いて検量線法により測定値を決定することができる。近年，スーパーサイエンスハイスクールなどの予算措置により一部の高等学校に紫外可視分光光度計が導入され，これらを用いた実験教材も開発されている²⁶⁾。本報で紹介した方法を用いると，分光光度計の設備のない多くの高等学校においても，このような実験教材を高等学校「化学�U」の課題研究のテーマとして有効に活用できるものと思われる。同様に，水質調査活動の分析手法として本報の吸光光度法を用いることにより，検液の呈色にかかわる化学反応，電磁波のスペクトル，物質による電磁波の吸収，吸光光度法による定量分析法などについての発展的学習を取り入れた高等学校「化学�U」課題研究の展開が期待される。

４　ま　と　め

　亜硝酸態窒素とCODの測定は，それぞれザルツマン法および過マンガン酸カリウム塩基性法による呈色液のデジタル画像を用いて吸収スペクトルをシミュレーションすることにより，吸光光度法による定量的な分析操作が可能である。ザルツマン法による亜硝酸態窒素の分析に対しては，G値を直接用いて吸光度を算出する既報の方法も，スペクトル変換法の近似法として妥当な方法である。これらの方法は，学校現場における水質調査活動において有効に活用できるものと思われる。

謝　辞

　本研究の一部は，科学研究費補助金基盤研究(B)18300267および(C)18500667による。

参考文献と注釈

1)      一部を日本化学会第87回春季年会(関西大学，2007年3月25〜28日)において発表した。講演番号1H2-49.

2)      例えば，環境省総合環境政策局環境教育推進室　編，環境学習2001年号，特集「水をテーマにした環境教育・環境学習の展開」，社団法人環境情報科学センター，2001.

3)      氷川　元，「自作簡易比色計による環境分析」，化学と教育, 41, 762-765(1993).

4)      紺野　昇，「パソコンを用いた自作比色計によるCOD測定」，化学と教育, 44, 608-609(1996).

5)      上田晃嗣，原　稔，「CODの簡易測定法の開発」，化学と教育, 46, 656-659(1998).

6)      黒川伸二，筒井浩司，前田友和，成富利英，「環境学習のためのCOD簡易測定法の開発」，化学と教育, 48, 764-767(2000).

7)      紺野　昇，杉本良一，芝本和代，「パソコンを用いた比色計による環境調査の教材化　−大気中の粉塵調査とその実践−」，科学教育研究, 24, 240-247(2000).

8)      松川　覚，田口さと子，「ピペットを用いたCOD測定の簡略化」，化学と教育, 53, 710-713(2005).

9)      田口哲，笠野恵子，「CCDカメラとコンピュータを用いた画像解析法による反応速度測定教材の開発」，化学と教育, 49, 158-159(2001).

10)   菊池洋一，柿崎仁美，井上祥史，武井隆明，村上祐，「デジタルカメラと画像処理ソフトを用いた天然水中の微量鉄の定量」，化学と教育, 50, 714-717(2002).

11)   古賀信吉，宇都岡貴秀，「RGB値のスペクトル変換による簡易可視分光法の化学実験への応用」，化学と教育, 52, 771-774(2004).

12)   小池守，高津戸秀，「自作の画像解析ソフトウエアとスキャナを用いた水質調査の教材化　−河川水中の亜硝酸イオン濃度の測定実験を通して−」，理科教育学研究, 46, 25-31(2006).

13)   S.K. Kohl, J.D. Landmark, and D.F. Stickle, “Demonstration of Absorbance Using Digital Color Image Analysis and Colored Solutions”, J. Chem. Educ., 83, 644-646(2006).

14)   B. Smits, “An RGB to Spectrum Conversion for Reflectances”, J. Graphics Tools, 4, 11-22(1999).

15)   Y. Sun et. al., “Deriving Spectra from Colors and Rendering Light Interface”, IEEE Computer Graphics Appl., 19, 61-67(1999).

16)   芳信孝宏，真鍋知久，金田和文，山下英生，「RGB画像からのスペクトル変換手法」，Visual ComputingグラフィックスとCAD合同シンポジウム2003, 北九州, 2003, pp.159-164.

17)   井上正之，古賀信吉，石原勢太郎，「PVCシートを用いたベンゼンスルホン酸の検出と簡易定量」，化学と教育, 54, 359-361(2006).

18)   井上正之，古賀信吉，「ベンゼンのマイクロスケールスルホン化」，化学と教育, 54, 496-499(2006).

19)   坂本一磨, 石原勢太郎, 古賀信吉，「デジタル画像のスペクトル変換解析を用いた吸光光度法による過酸化水素の分解反応の追跡，化学と教育, 55, 528-531(2007).

20)   N. Koga, “Simulation of Visible Spectra from Digital Color Image and its Application to Chemical Experiments at High Schools”, Proc. 2nd. NICE Symposium, Taipei 2007, pp.77-82.

21)   スルファニル酸0.48 gとN-1-ナフチルエチレンジアミンニ塩酸塩0.71 gを蒸留水に溶解した後，0.6 mol L^-1-塩酸10mLを加え，さらに蒸留水を加えて250 mLに希釈した。

22)   日本規格協会編，JISハンドブック環境測定�U，日本規格協会, 2006.

23)   高木誠司，定量分析の実験と計算，2 容量分析法(改訂版)，共立出版, 1969.

24)　それぞれの検液に対する分光法および変換法による分析値は，同一の呈色液に対する測定結果を示す。また，変換法およびG値法による分析値は，同一のデジタル画像から得た同一のRGB値を用いて得た結果を示す。これらの分析値の算出には，ぞれぞれ図４，図８，および図９に示した検量線を用いた。

25)   日本分析化学会北海道支部，水の分析，化学同人, 1971.

26)　梶山正明，「スーパーサイエンスハイスクールにおける実験教材の開発」，化学と教育，52, 592-595(2004).